FIZZ1-RELM-α誘導α-平滑肌動蛋白和Ⅰ型膠原在大鼠哮喘模型中高表達試驗研究.pdf

1、目的： 支氣管哮喘(簡稱哮喘)是由多種細胞(如嗜酸性粒細胞、T淋巴細胞、氣道上皮細胞等)和細胞組份參與的氣道炎癥性疾患。其主要病理特征是急慢性氣道炎癥，平滑肌功能紊亂和氣道重塑，是危害人類健康的常見病和多發(fā)病。早期研究認為哮喘是完全可逆性疾病，然而目前研究顯示哮喘的自然過程并非完全可逆。其根本原因可能是部分哮喘患者發(fā)生了早期的氣道重塑。氣道重塑的定義主要是以組織學描述為主，其中轉(zhuǎn)變表型的肌成纖維細胞和膠原沉積是早期氣道重塑的重要

2、特點。此類轉(zhuǎn)變表型的肌成纖維細胞能夠表達α-平滑肌動蛋白(α-SMA)，α-SMA是肌纖維細胞亞類之一，具有收縮潛能和較強的膠原合成能力，可導致管腔收縮。同時轉(zhuǎn)變表型的肌成纖維細胞也是肺內(nèi)膠原合成的主要細胞，它的聚集可促進膠原等細胞外基質(zhì)的過度沉積，尤其是Ⅰ型膠原，促使管壁增厚。所以a-SMA和Ⅰ型膠原被認為是判斷氣道重塑的重要指標?，F(xiàn)已知哮喘早期氣道重塑是多基因參與的結(jié)果，大量細胞因子活化，促進炎癥基因表達，引起氣道高反應性和氣道結(jié)構(gòu)

3、改變，致使哮喘早期氣道重塑形成。此過程中炎癥基因“發(fā)現(xiàn)于炎癥區(qū)分子1”(FIZZ1)的作用和功能備受關(guān)注。FIZZl或RELM-α是2000年首次發(fā)現(xiàn)的獨立新基因，命名為“發(fā)現(xiàn)于感染區(qū)”或者“類抵抗素分子”。其在肺和心臟等器官中特異性表達，并且在過敏性疾病中顯著高表達。同時FIZZ1也在小鼠慢性低氧肺模型中顯著高表達，因此FIZZ1也被稱為低氧誘導的有絲分裂因子(HlMF)。研究顯示FIZZ1在肺間質(zhì)纖維化動物模型的氣道上皮細胞和肺泡Ⅱ

4、型上皮細胞(AECⅡ)中特異性高表達，并且誘導肌成纖維細胞分化及細胞外基質(zhì)的沉積?，F(xiàn)已知哮喘患者早期氣道重塑也就是氣道纖維化的過程，因此，上述研究為哮喘氣道重塑過程提供了重要的線索。因此我們提出如下假說：FIZZ1可能是早期氣道重塑中重要的炎癥基因，誘導α-SMA和Ⅰ型膠原等氣道重塑的重要指標高表達。本研究擬通過探討支氣管哮喘大鼠肺組織Ⅱ型肺泡上皮細胞FIZZ1的表達水平，并觀察肺支氣管內(nèi)早期氣道重塑的表現(xiàn)。同時運用體外轉(zhuǎn)染FIZZ1基

5、因的方法，進一步證實FIZZ1對α-SMA和Ⅰ型膠原等早期氣道重塑主要指標的直接調(diào)節(jié)作用，描述炎癥基因FIZZ1與早期氣道重塑的關(guān)系。本研究通過揭示炎癥基因FIZZ1在哮喘發(fā)病過程中的作用，進一步闡述哮喘的發(fā)病機制。同時，也為尋求阻斷早期氣道重塑和不可逆氣流受限的方法，提供了理論依據(jù)。因此研究并應甩FIZZ1阻斷劑，將是一種很有前景的針對性治療策略。 方法： 健康WT大鼠70只，將大鼠隨機分為生理鹽水組(saline g

6、roup)，OVA哮喘組(OVA group)等各35只。復制大鼠哮喘模型；檢測大鼠的肺功能指標：氣道阻力(Re)和肺動態(tài)順應性(Cldyn)；分離兩組肺組織中Ⅱ型肺泡上皮細胞(AECⅡ)；采用逆轉(zhuǎn)錄-聚合酶鏈反應(RT-PCR)法檢測細胞內(nèi)FIZZ1mRNA的表達強度；免疫組化法測定肺支氣管中α-SMA表達水平；對肺成纖維細胞體外轉(zhuǎn)染pEGFP-FIZZ1融合質(zhì)粒和空載體質(zhì)粒，并且加入TGF-β1抗體，排除其對肌成纖維細胞的誘導作用；

7、采用酶聯(lián)免疫吸附法(ELISA)測定成纖維細胞提取物中的Ⅰ型膠原表達水平，同時采用免疫印跡法(western blotting)測定成纖維細胞提取物中α-SMA表達強度。 統(tǒng)計學分析：所有數(shù)據(jù)均以(均數(shù)±標準差)表示，采用SPSS10.0軟件處理。樣本間均數(shù)的比較采用t檢驗。P<0.05表示有統(tǒng)計學差異，P<0.01表示有顯著統(tǒng)計學差異。x線片和電泳圖采用Alphalmager 2200圖象分析軟件，免疫組化圖片采用Image-

8、prol-plus(美國馬里蘭公司生產(chǎn))軟件分析。 結(jié)果： 1．大鼠造模成功的臨床表現(xiàn)以大鼠出現(xiàn)煩躁不安、活動頻繁、呼吸急促、縮胸收腹，上肢抬起，點頭呼吸，以及大小便失禁等為誘喘成功的標志。 2．大鼠肺氣道阻力(Re)和肺動態(tài)順應性(Cldyn)的測定吸入濃度為0.025mg/Kg的ACH后，兩組大鼠的氣道阻力和肺動態(tài)順應性的實測值/基礎(chǔ)值基本無差別(P=0.379，P=0.843)：ACH濃度的提高到(0.05

9、-0.2mg/kg)，oVA哮喘組氣道阻力的實測值／基礎(chǔ)值增高比例明顯高于生理鹽水組(P<0.05)，同時OVA哮喘組肺動態(tài)順應性的實測值/基礎(chǔ)值顯著低于生理鹽水組(P<0.05)。 3．HE染色觀察肺部炎癥表現(xiàn)病理證實造模成功：大鼠OVA哮喘組中可見肺支氣管上皮細胞脫落壞死，氣管腔內(nèi)大量炎性細胞浸潤，包括嗜酸性粒細胞，T淋巴細胞等，以及管壁增厚，管腔狹窄等炎癥表現(xiàn)。 4．免疫組化檢測肺組織內(nèi)支氣管α-SMA的表達水平大

10、鼠OVA哮喘組中可見肺支氣管壁上存在大量被染成褐色α-SMA陽性免疫反應，OVA哮喘組發(fā)生了氣道重塑：生理鹽水組中可見α-SMA免疫反應信號呈陰性反應，僅可見到少數(shù)肺內(nèi)血管壁平滑肌呈弱陽性，未發(fā)生明顯的氣道重塑(P=1.49x10-5)。 5．FIZZ1 mRNA在Ⅱ型肺泡上皮細胞的表達水平肺泡Ⅱ型上皮細胞呈立方形，相互連接鑲嵌成片，呈島形分布。OVA哮喘組肺組織中FIZZ1 mRNA在AECⅡ中的表達強度較生理鹽水組顯著增強，

11、具有統(tǒng)計學意義(P=2.71×10-8)。 6．FIZZ1 mRNA的表達強度與α-SMA的相關(guān)性肺泡Ⅱ型上皮內(nèi)FIZZ1 mRNA的表達強度與肺組織中α-SMA呈線性正相關(guān)(r=0.95，P=3.24×10-6)。 7．肺內(nèi)成纖維細胞中Ⅰ型膠原的表達水平轉(zhuǎn)染pEGFP-FIZZ1質(zhì)粒的轉(zhuǎn)染組中纖維細胞提取物中的Ⅰ型膠原含量顯著高于轉(zhuǎn)染空載體質(zhì)粒的對照組，兩組差異具有統(tǒng)計學意義(P=3.64×10-4)。 8．肺

12、內(nèi)成纖維細胞中α-SMA的蛋白表達水平轉(zhuǎn)染組成纖維細胞提取物中α-SMA的蛋白表達水平顯著增強，而對照組無明顯表達。兩組差異具有統(tǒng)計學意義(P=0.0065)。 結(jié)論： 1．FIZZ1在哮喘動物模型Ⅱ型肺泡上皮細胞內(nèi)特異性高表達，同時誘導哮喘模型支氣管壁α-SMA蛋白的高表達。 2．FIZZ1可誘導肌成纖維細胞分化，促使哮喘早期氣道重塑特異性指標α-SMA和Ⅰ型膠原表達增強。證實FIZZ1是能夠獨立引起哮喘早期氣