氣道平滑肌細(xì)胞內(nèi)mRNA結(jié)合蛋白HuR對(duì)α-肌動(dòng)蛋白表達(dá)的影響.pdf

1、目的:
　　人氣道平滑肌細(xì)胞作為氣道最主要的組成部分，其形態(tài)功能異常是哮喘的重要病理生理變化之一，血小板源性生長(zhǎng)因子在損傷的氣道上皮細(xì)胞中有較高的表達(dá)，可以刺激平滑肌細(xì)胞的增生以及細(xì)胞內(nèi)多種蛋白的合成增加，從而引起平滑肌細(xì)胞形態(tài)、功能的改變，故血小板源性生長(zhǎng)因子在哮喘的發(fā)生發(fā)展中發(fā)揮著重要的作用。α-肌動(dòng)蛋白是人氣道平滑肌細(xì)胞的特征性標(biāo)志物，其含量可以反映人氣道平滑肌細(xì)胞的數(shù)量及其收縮能力的改變。作為最具代表性的mRNA結(jié)合蛋白，

2、HuR可與目的蛋白mRNA3'UTR的AREs結(jié)合，從細(xì)胞核穿梭入細(xì)胞質(zhì)，使mRNA翻譯增加，下游蛋白表達(dá)量增加;研究表明，α-肌動(dòng)蛋白mRNA的3'端也存在AREs，所以我們猜測(cè)，HuR蛋白可能與α-SMA mRNA3'UTR的AREs結(jié)合，增強(qiáng)其穩(wěn)定性，從而增加α-SMA蛋白量的表達(dá)。本研究采用體外培養(yǎng)人氣道平滑肌細(xì)胞的方法，應(yīng)用血小板源性刺激因子刺激模擬哮喘的病理狀態(tài)，觀察HuR蛋白對(duì)人氣道平滑肌細(xì)胞中α-SMA表達(dá)的影響。

3、>　　方法:
　　1.分組:①PDGF0 h組;②PDGF6 h組;③PDGF12h組;④PDGF24 h組;⑤siRNA+PDGF0 h組;⑥siRNA+PDGF12 h組;⑦consiRNA+PDGF0 h組;⑧consiRNA+PDGF12 h組;
　　2.應(yīng)用Western blot，檢測(cè)血小板源性刺激因子刺激后，人氣道平滑肌細(xì)胞中人抗原R蛋白、α-SMA蛋白的水平。
　　3.應(yīng)用RT-PCR方法，檢測(cè)各組人氣

4、道平滑肌細(xì)胞中HuR及α-SMA的RNA水平。
　　4.使用siRNA沉默HuR蛋白，研究血小板源性刺激因子對(duì)人氣道平滑肌細(xì)胞中α-SMA表達(dá)的影響。
　　結(jié)果:
　　血小板源性刺激因子呈時(shí)間依懶性增強(qiáng)細(xì)胞內(nèi)HuR及α-SMA的表達(dá)，各組細(xì)胞HuR蛋白及mRNA相對(duì)表達(dá)量分別為:①PDGF刺激0h組:0.23±0.09、1.00±0.00;②PDGF刺激6h組:0.42±0.11、1.09±0.03;③PDGF刺激12

5、 h組:0.93±0.21、1.16±0.03;④PDGF刺激24 h組:1.37±0.28、1.27±0.02;（均P＜0.05）;各組α-SMA蛋白以及mRNA相對(duì)表達(dá)量分別為:①PDGF刺激0h組:1.03±0.08、1.00±0.00;②PDGF刺激6h組:1.20±0.09、1.17±0.02;③PDGF刺激12 h組:1.39±0.11、1.23±0.02;④PDGF刺激24 h組:1.58±0.10、1.45±0.03;（

6、均P＜0.05）。siRNA特異沉默HuR后，α-SMA表達(dá)量也相應(yīng)減弱。HuR沉默后，平滑肌細(xì)胞中PDGF誘導(dǎo)的α-SMA的表達(dá)減少，HuR及α-SMA的蛋白相對(duì)表達(dá)量分別為:consiRNA+PDGF0 h組:1.20±0.11、0.34±0.07; consiRNA+PDGF12 h組:1.50±0.10、0.82±0.12; siHuR+PDGF0h組:1.23±0.13、0.37±0.09; siHuR+PDGF12h組:0.

7、89±0.11、0.35±0.08。siHuR+PDGF0h組與consiRNA+PDGF0 h組HuR及α-SMA蛋白相對(duì)表達(dá)量差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(均P＞0.05)，而特異的HuR干擾RNA轉(zhuǎn)染細(xì)胞能顯著降低HuR的表達(dá)，siHuR+PDGF12h組HuR蛋白相對(duì)表達(dá)量顯著低于consiRNA+PDGF12h組(P＜0.05);同時(shí)PDGF誘導(dǎo)的α-SMA蛋白表達(dá)升高受到顯著抑制，siHuR+PDGF12h組α-SMA蛋白相對(duì)表達(dá)量低