1型多聚ADP核糖合成酶通過(guò)PPARα通路抑制脂肪酸氧化導(dǎo)致脂質(zhì)代謝紊亂的機(jī)制研究.pdf

1、本文分三個(gè)部分進(jìn)行探討：
　　第一部分：1型多聚ADP核糖合成酶在高飽和脂肪酸飲食所致甘油三酯代謝紊亂過(guò)程中的作用機(jī)制研究
　　目的：使用1型多聚ADP核糖合成酶（poly(ADP-ribose) polymerase1，PARP1）基因敲除小鼠，通過(guò)給予高飽和脂肪酸飲食喂養(yǎng)構(gòu)建高甘油三酯血癥動(dòng)物模型，探討PARP1在高甘油三酯血癥中的作用和機(jī)制。
　　方法：選擇體重在18-20g，8-10周齡的雄性野生型129S1/

2、SvImJ小鼠及PARP1基因敲除小鼠（PARP1-/-,129S-Parp1tm1Zqw/J,PKO）為實(shí)驗(yàn)對(duì)象，各隨機(jī)分為4組，分別給予普通飲食和高飽和脂肪酸飲食喂養(yǎng)。在實(shí)驗(yàn)開(kāi)始第0周，首次測(cè)量體重，并經(jīng)內(nèi)眥靜脈采血，分離血清后檢測(cè)血甘油三酯和非酯化脂肪酸含量。以后于第14、28天測(cè)量一次小鼠體重。在實(shí)驗(yàn)第27天，小鼠禁食6小時(shí)后，分別行小鼠灌胃給予葡萄糖耐量試驗(yàn)、腹腔注射胰島素耐量試驗(yàn)，評(píng)價(jià)小鼠胰島素抵抗?fàn)顟B(tài)。第28天小鼠在禁食8

3、小時(shí)后，取血分離血清，再次檢測(cè)血甘油三酯和非酯化脂肪酸含量。處死小鼠后，取肝臟織樣本使用多聚甲醛固定留作病理切片，或者凍存作分子生物學(xué)檢測(cè)。病理學(xué)檢測(cè)包括HE及油紅染色肝臟組織切片觀察肝臟脂肪變性情況；使用蛋白印跡實(shí)驗(yàn)等方法檢測(cè)老鼠肝臟中PARP活性，real time RT-PCR檢測(cè)肝臟組織中甘油三酯代謝相關(guān)基因RNA表達(dá)水平，凝膠遷移電泳檢測(cè)肝臟組織中過(guò)氧化物酶體增殖物受體α的DNA結(jié)合能力。
　　結(jié)果：高飽和脂肪酸飲食喂養(yǎng)

4、后，小鼠肝臟組織中PARP活性明顯增高。PARP1敲除或PARP1抑制劑均可以明顯改善高飽和脂肪酸飲食所致的血脂異常和肝臟脂質(zhì)沉積。敲除PARP1或PARP抑制劑可以增強(qiáng)過(guò)氧化物酶體增殖物受體α的DNA結(jié)合能力，并顯著增加參與脂肪酸氧化相關(guān)基因的表達(dá)水平。
　　結(jié)論：PARP1基因敲除后可以明顯改善由高飽和脂肪酸飲食誘導(dǎo)的甘油三酯代謝紊亂，PARP1在脂質(zhì)代謝紊亂過(guò)程中發(fā)揮重要作用。
　　第二部分：不同種類脂肪酸對(duì)1型多聚A

5、DP核糖合成酶活性作用的研究
　　目的：1型多聚ADP核糖合成酶（PARP1）的過(guò)度激活在各種生理病理過(guò)程中發(fā)揮著關(guān)鍵的作用，研究不同種類脂肪酸對(duì)PARP1活性的影響，探索高飽和脂脂酸飲食引起脂質(zhì)代謝紊亂的原因。
　　方法：培養(yǎng)野生型小鼠肝臟原代細(xì)胞，使用相同濃度的單不飽和脂肪酸、多不飽和脂肪酸和飽和脂肪酸刺激肝臟細(xì)胞，檢測(cè)肝臟細(xì)胞中PARP1的活性。并且使用免疫共沉淀觀察不同種類脂肪酸刺激細(xì)胞后過(guò)氧化物酶體增殖物受體α（P

6、PARα）的多聚ADP核糖化水平。同時(shí)培養(yǎng)野生型小鼠和PARP1基因敲除小鼠肝臟原代細(xì)胞，觀察不同種類脂肪酸對(duì)脂肪酸代謝相關(guān)基因表達(dá)的影響。
　　結(jié)果：?jiǎn)尾伙柡椭舅崤c多不飽和脂肪酸不能使PARP1活性的增加，而飽和脂肪酸則可以激活PARP1，且呈濃度依賴性。并且較之單不飽和脂肪酸與多不飽和脂肪酸，飽和脂肪酸增加PPARα的多聚ADP核糖化水平。實(shí)時(shí)定量PCR結(jié)果表明飽和脂肪酸在野生型細(xì)胞中不能夠增加PPARα下游靶基因的表達(dá)，但

7、是在PARP1敲除細(xì)胞中則可以上調(diào)PPARα下游靶基因的表達(dá)。
　　結(jié)論：三種脂肪酸中只有飽和脂肪酸可以激活PARP1，飽和脂肪酸在PARP1敲除細(xì)胞中可以增加PPARα下游靶基因的表達(dá)，PARP1的激活是高飽和脂肪酸飲食引起脂質(zhì)代謝紊亂的關(guān)鍵因素。
　　第三部分：人肝臟組織1型多聚ADP核糖合成酶活性的觀察
　　目的：觀察人肝臟組織中1型多聚ADP核糖合成酶（PARP1）活性以及與肝臟組織中脂質(zhì)含量的關(guān)系。
　

8、　方法：收集臨床病人的肝臟組織，選取病理學(xué)檢查正常的肝臟組織作為實(shí)驗(yàn)對(duì)象，使用Universal colorimetric PARP assay試劑盒檢測(cè)肝臟組織標(biāo)本中PARP活性，并且檢測(cè)相應(yīng)肝臟組織中甘油三酯和非酯化脂肪酸的含量，使用Pearson相關(guān)模型分析PARP活性與脂質(zhì)含量之間的關(guān)系。并且用PARP1激動(dòng)劑和抑制劑孵育人肝癌細(xì)胞系hepG2細(xì)胞，用油紅O檢測(cè)脂質(zhì)沉積程度。
　　結(jié)果：人肝臟組織中PARP活性與甘油三酯（