癢疹樣營(yíng)養(yǎng)不良型大皰性表皮松解癥的COL7A1基因突變研究.pdf

1、背景：大皰性表皮松解癥(epidermolysis bullosa，EB)是表皮與真皮分離的在臨床上有多種表現(xiàn)的一組遺傳性皮膚病的總稱，根據(jù)超微結(jié)構(gòu)顯示組織分裂的準(zhǔn)確位置，EB可分為四種主要類型：?jiǎn)渭冃虴B(epidermolysis bullosa simplex，EBS)；交界型EB(junctional epidermolysis bullosa，JEB)；營(yíng)養(yǎng)不良型EB(dystrophicepidermolysis bullo

2、sa，DEB)和Kindler綜合征(Kindler syndrome)。EBS：裂隙發(fā)生在基底的角質(zhì)形成細(xì)胞內(nèi)，是角蛋白5、14或plectin蛋白異常所致；JEB：裂隙主要發(fā)生在透明板，是lamina-332，整聯(lián)蛋白α6β4或ⅩⅦ型膠原異常所致；DEB：裂隙發(fā)生在致密板下錨絲纖維水平，是Ⅶ型膠原異常所致；而Kindler綜合征患者的裂隙可以發(fā)生于表真皮交界處的任何結(jié)構(gòu)部位，主要由于粘著斑相關(guān)蛋白Fermitin家族同源物1蛋白異常

3、所導(dǎo)致。DEB的表皮松解部位發(fā)生于致密板下帶，根據(jù)遺傳方式的不同可分為常染色體顯性(DDEB)和常染色體隱性遺傳(RDEB)兩種類型。近年來(lái)隨著分子生物學(xué)技術(shù)的發(fā)展研究表明DEB是由位于基底膜致密板下帶錨絲纖維的主要組成部分-Ⅶ型膠原基因COL7A1突變導(dǎo)致。癢疹樣營(yíng)養(yǎng)不良型大皰性性表皮松解癥(dystrophic epidermolysis bullosapruriginosa，DEBP)是DEB的一種少見臨床亞型。DEBP患者可于出

4、生后早期表現(xiàn)為DEB的臨床表型，并隨著年齡增長(zhǎng)，伴隨著水皰或大皰性損害減少，逐漸出現(xiàn)癢疹樣損害；患者也可以出生后無(wú)任何臨床表現(xiàn)，逐漸于雙脛前緩慢出現(xiàn)癢疹樣改變，伴有輕度的甲營(yíng)養(yǎng)不良性改變；少數(shù)患者可在成年后才出現(xiàn)典型的DEBP皮損而無(wú)任何其他DEB的臨床表現(xiàn)；極少數(shù)DEBP患者還可以在典型臨床表現(xiàn)的基礎(chǔ)上出現(xiàn)白色丘疹樣皮疹。DEBP可呈常染色體顯性遺傳或隱性遺傳，但多數(shù)病例呈常染色體顯性遺傳。目前，已報(bào)導(dǎo)引起DEBP的突變包括錯(cuò)義突變、

5、移碼突變以及剪切位點(diǎn)突變。其中，引起COL7A1基因編碼的Ⅶ型膠原三螺旋區(qū)的甘氨酸替代的雜合錯(cuò)義突變?yōu)镈EBP最常見的基因突變類型。這是由于Ⅶ型膠原蛋白結(jié)構(gòu)特征是Gly-Xaa-Yaa連續(xù)重復(fù)，由于甘氨酸是最小的氨基酸，對(duì)于膠原蛋白的結(jié)構(gòu)和功能至關(guān)重要，當(dāng)甘氨酸被其他種類的氨基酸替代后，可能干擾Ⅶ型膠原的三螺旋結(jié)構(gòu)域的形成，妨礙其結(jié)構(gòu)的完整性和穩(wěn)定性，使皮膚基底膜致密板下帶錨纖維(其主要成分為Ⅶ型膠原)不能維持正常的功能，導(dǎo)致DEBP發(fā)

6、生。但引起DEBP患者劇烈瘙癢并最終在反復(fù)搔抓刺激下出現(xiàn)癢疹樣改變的具體原因尚不清楚。本研究擬對(duì)收集到的3例臨床表型差異較大的DEBP病例進(jìn)行COL7A1基因突變的研究，進(jìn)一步探討DEBP患者臨床表型與基因型之間可能的關(guān)聯(lián)，豐富DEBP突變的數(shù)據(jù)庫(kù)，為患者家系的產(chǎn)前診斷奠定基礎(chǔ)。
　　 目的：檢測(cè)三例癢疹樣營(yíng)養(yǎng)不良型大皰性表皮松解癥患者的COL7A1基因突變情況。
　　 方法：⑴收集三例患者臨床資料，病例1為17歲男性，

7、出生后反復(fù)于手、足等摩擦部位出現(xiàn)水皰及大皰，消退后留有輕度增生性瘢痕。隨年齡增大，患者摩擦性水皰逐漸減輕，但緩慢于雙脛前、背部、上肢伸側(cè)出現(xiàn)扁平丘疹及結(jié)節(jié)，伴有劇烈瘙癢，家族中其母親及多位親屬有類似情況，否認(rèn)父母近親結(jié)婚。病例2和病例3均為成年女性，青春期后發(fā)病，主要表現(xiàn)雙脛前、背部逐漸增多的結(jié)節(jié)，伴有劇烈瘙癢。病例2有家族史，病例3為散發(fā)病人。查體：三例患者均可見到雙脛前、背部多發(fā)的淡粉紅色或褐色扁平丘疹及結(jié)節(jié)，表皮剝蝕，部分表面伴有

8、明顯角化，其中病例1皮疹較為廣泛多發(fā)，并且伴有腹部多發(fā)膚色扁平膚色或者白色丘疹及增生性瘢痕。三例患者均可見到甲變薄，遠(yuǎn)端萎縮甚至缺如。三例患者的皮膚組織病理均提示：角化過(guò)度，棘層肥厚，表皮下輕度裂隙，真皮淺層血管周圍少量淋巴細(xì)胞浸潤(rùn)。⑵電鏡檢查標(biāo)本制備：環(huán)鉆鉆取病例1及病例3脛前結(jié)節(jié)處皮損一塊(3mm)，立即用5％戊二醛溶液固定，送至電鏡室行透射電鏡檢測(cè)。⑶DNA的提取取患者及其親屬外周血5ml，2％EDTA抗凝，以低滲溶血以及酚一氯仿

9、抽提法提取DNA。⑷PCR擴(kuò)增及DNA測(cè)序根據(jù)COL7A1基因序列設(shè)計(jì)72對(duì)特異性引物擴(kuò)增3例患者全部外顯子，同時(shí)擴(kuò)增患者親屬及150例無(wú)關(guān)正常人對(duì)照的相應(yīng)突變外顯子。擴(kuò)增條件：94℃預(yù)變性5min；94℃變性45s，56℃～62℃退火1 min，72℃延伸1min，共35個(gè)循環(huán)；72℃后延伸10min。1.5％的瓊脂糖凝膠電泳檢查PCR產(chǎn)物；所有PCR產(chǎn)物經(jīng)純化后送至北京天一輝遠(yuǎn)測(cè)序公司測(cè)序。
　　 結(jié)果：病例1及2有家族史，

10、病例3為散發(fā)患者。病例1和3皮損透射電鏡顯示部分區(qū)域錨纖維絲輕度減少，病例1可見致密板下裂隙。以三例患者的基因組DNA為模板，所有72對(duì)引物在各自的條件下分別擴(kuò)增出各自的產(chǎn)物，包括所有118個(gè)外顯子的編碼序列以及側(cè)翼序列。所有產(chǎn)物純化后測(cè)序結(jié)果與Ensembl網(wǎng)站所公布的COL7A1基因序列進(jìn)行對(duì)照，發(fā)現(xiàn)病例1的COL7A1基因編碼外顯子的第6734位核苷酸發(fā)生G→T雜合突變，使位于85號(hào)外顯子2245位密碼子發(fā)生GGT→GTT突變，導(dǎo)

11、致Gly2245Val雜合突變，其母親及家族中其他患者帶有該突變，其父親未檢測(cè)到該突變：病例2的COL7A1基因編碼外顯子的第6859位核苷酸發(fā)生G→A雜合突變，使位于87號(hào)外顯子2287位密碼子發(fā)生GGA→AGA突變，導(dǎo)致Gly2287Arg雜合突變，家族中其他患者帶有該突變；病例3的COL7A1基因編碼外顯子的第5318位核苷酸發(fā)生G→T雜合突變，使位于42號(hào)外顯子1773位密碼子發(fā)生GGT→GTT突變，導(dǎo)致Gly1773Val雜合

12、突變，其未患病的父母未檢測(cè)到該突變，提示其為新發(fā)突變。突變?cè)诓±?和2家族中的患者均呈現(xiàn)共分離現(xiàn)象。所有突變均由反向測(cè)序得到驗(yàn)證。150例無(wú)關(guān)正常人對(duì)照均未發(fā)現(xiàn)這三種突變。
　　 結(jié)論：COL7A1的p.G2245V、p.G2287R和p.G1773V甘氨酸替代突變，可能是引起這三例患者臨床表型的病因，進(jìn)一步證實(shí)甘氨酸替代突變?cè)贒EBP中的重要致病意義；其中p.G2245V、p.G1773V為兩種未報(bào)道過(guò)的新突變，這豐富了DEB