杜氏肌營(yíng)養(yǎng)不良癥和結(jié)節(jié)性硬化癥的基因突變分析.pdf

1、杜氏肌營(yíng)養(yǎng)不良癥(Duchenne muscular dystrophy，DMD)是一種以四肢近端骨骼肌進(jìn)行性變性、壞死和小腿腓腸肌假性肥大為主要臨床特征的X—連鎖隱性遺傳病。該病由抗肌萎縮蛋白(dystrophin)發(fā)生結(jié)構(gòu)和功能的改變所致。本病主要累及男性，發(fā)病率約占活產(chǎn)男嬰的1/3500，女性大部分為攜帶者，通常不發(fā)病。目前尚無有效的治療方法。 本研究主要選定MLPA和DHPLC這兩種突變檢測(cè)方法，輔以短串聯(lián)重復(fù)(shor

2、t tandem repeat，STR)連鎖分析的方法，對(duì)疑似的DMD患者、攜帶者和高危胎兒進(jìn)行MLPA檢測(cè)，對(duì)高危胎兒家系成員進(jìn)行STR連鎖分析，再采用DHPLC方法篩查非缺失/重復(fù)型患者的點(diǎn)突變。本研究旨在改善DMD的分子診斷策略，對(duì)DMD患者、攜帶者、高危胎兒進(jìn)行全面有效的基因檢測(cè)，并將這一分子診斷策略應(yīng)用于臨床的遺傳咨詢和產(chǎn)前診斷中。 材料與方法: 一、實(shí)驗(yàn)材料 臨床診斷為DMD的患者46例，男性，年齡1

3、.5月～16歲；疑似攜帶者6例，女性，均為患兒母親；DMD高危胎兒3個(gè)。以上病例均由中國(guó)醫(yī)科大學(xué)附屬盛京醫(yī)院提供家系成員的外周血，臍帶血或者羊水細(xì)胞及相關(guān)病歷資料。經(jīng)過MLPA檢測(cè)陰性的患兒標(biāo)本16例，男性11例，女性5例，來自中國(guó)醫(yī)學(xué)科學(xué)院基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)研究所遺傳室。10例正常男性和10例正常女性外周血作為本研究的正常對(duì)照。常規(guī)酚氯仿方法提取基因組DNA，部分血樣和1例胎兒臍帶血，3例胎兒羊水細(xì)胞使用Universal Genomic DN

4、A Extraction Kit Ver．3.0試劑盒提取基因組DNA，購(gòu)自日本TaKaRa公司。MLPA DMD試劑盒(SALSA MLPA KIT P034/035DMD/Becker)購(gòu)自荷蘭MRC—Holland公司。主要儀器有UNOⅡ48型PCR擴(kuò)增儀(德國(guó)Biometra公司)，Beckman CEQ—8000遺傳分析儀(美國(guó)Beckman公司)和WAVE()核酸片段分析系統(tǒng)(美國(guó)Transgenomic公司)。 二

5、、實(shí)驗(yàn)方法 (一)應(yīng)用MLPA技術(shù)篩查dystrophin基因缺失/重復(fù)突變 MLPA DMD試劑盒的兩組探針P034和P035，分別針對(duì)dystrophin基因第1～79外顯子的特定序列設(shè)計(jì)。50～500 ng DNA溶于5μl Tris—EDTA，95℃變性5min。當(dāng)溫度迅速降到25℃時(shí)，加入探針混合物P034(或P035)，充分混勻后，95℃變性5min，60℃雜交過夜。雜交16h～18h后，下降溫度至54℃后

6、加入連接酶Ligase—65，54℃連接15min，98℃5min滅活Ligase—65。最后用SALSA FAM PCR引物對(duì)連接的探針進(jìn)行PCR擴(kuò)增。將PCR產(chǎn)物和作為內(nèi)標(biāo)的Size standard600以80：1混合，經(jīng)Beckman CEQ—8000遺傳分析儀進(jìn)行毛細(xì)管電泳分離PCR擴(kuò)增產(chǎn)物，所得數(shù)據(jù)經(jīng)Beckman CEQ—8000遺傳分析儀的Fragment Analysis軟件分析得到原始峰圖，再使用Coffalyser

7、 Version9.0(http：//www．mlpa．com/coffalyser/download．html)軟件對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行分析，計(jì)算出被檢測(cè)樣本的每個(gè)外顯子的拷貝數(shù)的相對(duì)峰面積比(relative peak ratio，RPR)，得出對(duì)應(yīng)外顯子的直方圖。10例正常男性和10例正常女性樣本作為分析對(duì)照。對(duì)單外顯子缺失的結(jié)果，經(jīng)PCR和測(cè)序進(jìn)一步驗(yàn)證。對(duì)單外顯子重復(fù)的患者，進(jìn)行3次重復(fù)實(shí)驗(yàn)。 (二)對(duì)MLPA檢測(cè)陰性患者應(yīng)用D

8、HPLC技術(shù)篩查dystrophin基因點(diǎn)突變 運(yùn)用DHPLC技術(shù)對(duì)MLPA結(jié)果為非缺失/重復(fù)型患者進(jìn)行進(jìn)一步篩查。針對(duì)79個(gè)外顯子及其側(cè)翼序列設(shè)計(jì)引物，在UNOⅡ48型PCR擴(kuò)增儀里分別進(jìn)行PCR擴(kuò)增。未純化的PCR產(chǎn)物與同樣條件擴(kuò)增的男性對(duì)照產(chǎn)物等體積混合，進(jìn)行變性及緩慢復(fù)性。DHPLC分析采用WAVE()核酸片段分析系統(tǒng)進(jìn)行。首先經(jīng)WAVEMARKER4.1軟件分析，確定dystrophin基因各擴(kuò)增片段最佳分離梯度和檢測(cè)

9、溫度。將上述處理過的擴(kuò)增產(chǎn)物直接用于DHPLC檢測(cè)。對(duì)DHPLC檢測(cè)出現(xiàn)峰形異常者用Beckman CEQ—8000遺傳分析儀進(jìn)行DNA測(cè)序。對(duì)變異的位點(diǎn)，通過檢索DMD數(shù)據(jù)庫(kù)(www．dmd．nl)判斷是否為已報(bào)道突變，通過檢索單核苷酸多態(tài)性數(shù)據(jù)庫(kù)判定是否為已知的SNP。 (三)應(yīng)用MLPA結(jié)合STR連鎖分析方法進(jìn)行DMD高危胎兒的產(chǎn)前診斷 在孕婦妊娠16～22周時(shí)，B超監(jiān)控下抽取羊水，以生理鹽水反復(fù)清洗羊水細(xì)胞，離心

10、后收集細(xì)胞沉淀，使用日本TaKaRa公司Universal Genomic DNAExtraction Kit Ver．3.0試劑盒提取基因組DNA，相同方法提取胎兒家系成員的外周靜脈血基因組DNA。對(duì)家系中的先證者、疑似攜帶者和胎兒進(jìn)行MLPA分析，方法同上。先證者、攜帶者和胎兒MLPA分析結(jié)果都是非缺失/重復(fù)型的家系，選取平均分布于dystrophin基因及其側(cè)翼序列的5個(gè)STR標(biāo)記，分別設(shè)計(jì)引物序列，PCR擴(kuò)增STR標(biāo)記后進(jìn)行變性

11、聚丙烯酰胺凝膠電泳，分析STR標(biāo)記的等位基因型。 結(jié)果： 一、DMD患者及可疑攜帶者M(jìn)LPA分析結(jié)果 臨床診斷為DMD的患者共46例，經(jīng)MLPA篩查發(fā)現(xiàn)有24例(52.2％)出現(xiàn)外顯子拷貝數(shù)的改變，其中15例為多外顯子缺失，5例為單外顯子缺失，重復(fù)突變4例。檢測(cè)到點(diǎn)突變1例，編號(hào)D3的患兒和他的母親MLPA結(jié)果均顯示第58外顯子的缺失，經(jīng)過進(jìn)一步PCR(嚴(yán)格設(shè)立陽(yáng)性對(duì)照和陰性對(duì)照)驗(yàn)證，與MLPA結(jié)果不一致，測(cè)序

12、驗(yàn)證為該外顯子內(nèi)部的一個(gè)點(diǎn)突變c．8608C>T(p.Arg2870X)，最終導(dǎo)致2870位的精氨酸變成了提前的終止密碼。對(duì)6例可疑的攜帶者進(jìn)行檢測(cè)，其中5例攜帶與其患病家屬相同的突變。 二、DHPLC分析結(jié)果和測(cè)序結(jié)果 檢測(cè)了16例非缺失/重復(fù)型(MLPA檢測(cè))DMD患者，11例男性患者，5例女性患者，篩查涉及dystrophin基因的79個(gè)外顯子，但目前沒有發(fā)現(xiàn)致病的突變。16例患兒均出現(xiàn)DHPLC的峰形改變，對(duì)DH

13、PLC峰形出現(xiàn)改變的樣品進(jìn)行測(cè)序，沒有檢測(cè)到致病突變，檢測(cè)到一些遺傳變異。 三、DMD高危胎兒產(chǎn)前診斷結(jié)果 采用聯(lián)合MLPA和STR連鎖分析方法對(duì)3個(gè)DMD高危胎兒進(jìn)行產(chǎn)前診斷，對(duì)三個(gè)家系中的先證者、可疑攜帶者和胎兒同時(shí)進(jìn)行MLPA分析，根據(jù)我們的結(jié)果，胎兒性別都為女性。在家系1的先證者檢測(cè)到第44外顯子的缺失，經(jīng)PCR驗(yàn)證，與MLPA結(jié)果一致，但胎兒未檢測(cè)到缺失/重復(fù)。在家系2和家系3中，經(jīng)MLPA方法檢測(cè)，所有成員(

14、包括胎兒)都是MLPA非缺失/重復(fù)型，同時(shí)對(duì)這2個(gè)家系進(jìn)行STR連鎖分析，STR結(jié)果也顯示2個(gè)胎兒均為女性，且這兩個(gè)女性胎兒不是潛在攜帶者，患病風(fēng)險(xiǎn)低。 結(jié)論: 1、應(yīng)用MLPA技術(shù)在46例DMD患者中檢測(cè)到缺失突變20例，重復(fù)突變4例；在6例疑似攜帶者中檢測(cè)到缺失突變3例，重復(fù)突變1例，都攜帶與其患病家屬相同的突變。由此可見MLPA方法可以準(zhǔn)確可靠的檢測(cè)dystrophin缺失、重復(fù)突變和攜帶者的雜合突變狀態(tài)，覆蓋全部