假性肥大型進(jìn)行性肌營(yíng)養(yǎng)不良癥基因診斷的研究.pdf

1、[研究背景]： 假性肥大型進(jìn)行性肌營(yíng)養(yǎng)不良癥(DuchennemusculardystrophyDMD/BMD)是源于橫紋肌的一種X-連鎖隱性致死性遺傳病，進(jìn)行性肌萎縮和腓腸肌無(wú)力伴小腿腓腸肌假性肥大是其典型的臨床特征，男性活產(chǎn)嬰兒的發(fā)病率為1/3500，DMD患者臨床癥狀差異較大，可依據(jù)患者囚于輪椅年齡的遲早把本病分為三種臨床亞型：DMD型、IMD型(intermediatemusculardystrophy)和BMD型(Be

2、cker’smusculardystrophy)。一般3～6歲發(fā)病，進(jìn)行性加重，12歲左右即不能行走，約20歲夭折，本病由抗肌萎縮蛋白(Dystrophin)基因突變引起。抗萎縮蛋白基因是1986年哈佛大學(xué)DrKunkel通過(guò)定位克隆技術(shù)克隆，定位于Xp21，是目前發(fā)現(xiàn)的最大的人類基因，約占X染色體的2％，全基因組的0.05％，基因長(zhǎng)約2600Kb，含79個(gè)外顯子，內(nèi)含子平均長(zhǎng)約35Kb，內(nèi)含子和外顯子的堿基比約為200:1，DMDcD

3、NA的長(zhǎng)度為14Kb，，并且發(fā)現(xiàn)DMD基因突變是本病三種臨床亞型患者發(fā)病共同的分子遺傳學(xué)基礎(chǔ)。 DMD基因由79個(gè)外顯子和78個(gè)內(nèi)含子組成，在組織中存在多種轉(zhuǎn)錄拼接類型，可編碼多種氨基酸殘基數(shù)目各異蛋白。DMD基因突變是本病的分子遺傳學(xué)基礎(chǔ)。據(jù)報(bào)道，約60％的基因突變?yōu)椴煌潭却笃稳笔В?～10％為大片段重復(fù)，其余為常規(guī)方法難以檢測(cè)的微小突變?；蛲蛔冎饕膳詡鹘o后代，但約有1/3為新突變。迄今尚無(wú)有效的治療方法。富有前途的

4、治療方法有基因治療和成肌細(xì)胞移植。其防治的基本措施是對(duì)DMD高危孕婦進(jìn)行胎兒產(chǎn)前基因診斷，不讓有病患兒出生。對(duì)此病進(jìn)行深入研究是非常必要的。 [目的]： 建立一套準(zhǔn)確、簡(jiǎn)便、可行的方案，對(duì)DMD家系進(jìn)行基因診斷和產(chǎn)前診斷。 [方法]： 1.18對(duì)熒光引物多重PCR分析方法2.依賴探針連接的多重?cái)U(kuò)增技術(shù)(MLPA)3.短串聯(lián)重復(fù)序列多態(tài)位點(diǎn)(STR)連鎖分析方法4.HLA-ABDRSSP方法5.AmpFIS

5、TRldemifilerPCRAmplificationKit(ABI，美國(guó))6.羊水細(xì)胞培養(yǎng)7.采用SPSS11.5軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)[結(jié)果]： 我們把18對(duì)熒光引物多重PCR分析方法、依賴探針連接的多重?cái)U(kuò)增技術(shù)(MLPA)和短串聯(lián)重復(fù)序列多態(tài)位點(diǎn)(STR)連鎖分析方法有機(jī)結(jié)合，完成了425個(gè)家系的基因診斷，聯(lián)合Identifiler試劑盒和羊水細(xì)胞培養(yǎng)技術(shù)對(duì)52個(gè)孕婦進(jìn)行基因產(chǎn)前診斷。 1.同時(shí)用18對(duì)熒光引物多重PCR分

6、析方法和依賴探針連接的多重?cái)U(kuò)增技術(shù)(MLPA)對(duì)80例患者和其母親進(jìn)行檢測(cè)。MLPA結(jié)果：檢出率為69％，58％(46/80)患者為DMD基因缺失，其中41％(19/46)DMD基因缺失患者的母親為攜帶者；11％(9/80)患者為DMD基因重復(fù)，100％(9/9)DMD基因重復(fù)患者的母親都為攜帶者。6名患者(4名為基因缺失，2名為基因重復(fù))是多重PCR方法漏檢的，MLPA技術(shù)可增加8％(6/80)檢出率。 2.采用依賴探針連接的

7、多重?cái)U(kuò)增技術(shù)(MLPA)對(duì)425名DMD患者和其母親進(jìn)行檢測(cè)，248個(gè)病例為缺失突變，占58.4％；44例為重復(fù)突變，占10.4％；其中新突變有109例，占37.2％。 3.52個(gè)做產(chǎn)前診斷家庭中，先證者為缺失突變31例，為重復(fù)突變9例，為非缺失和重復(fù)突變12例。 4.53例羊水標(biāo)本經(jīng)Identifiler試劑盒檢測(cè)，其中男性胎兒35例，女性胎兒18例；其中3份污染了母血，經(jīng)羊水培養(yǎng)后，再檢測(cè)均無(wú)污染；DMD基因分析：用

8、MLPA方法分析41例，用STR連鎖分析6例。35例男胎中，9例為患胎，行引產(chǎn)術(shù)，其中2例只做性別的男胎行引產(chǎn)術(shù)，26例男胎診斷為正常繼續(xù)妊娠。18例女胎中8例正常，4例攜帶者，其中4例只做性別檢測(cè)。經(jīng)產(chǎn)前診斷出生的小孩已都進(jìn)行血清酶學(xué)檢查作為產(chǎn)后追蹤，結(jié)果并沒(méi)發(fā)現(xiàn)異常。 5.6例羊水DMD基因檢測(cè)正常標(biāo)本采用HLA-ABDRSSP方法與先證者進(jìn)行比對(duì)，其中一例人類白細(xì)胞抗原(HLA)全相合，建議分娩時(shí)保存臍帶血。 [結(jié)

9、論]： 1、依賴探針連接的多重?cái)U(kuò)增技術(shù)(MLPA)可同時(shí)檢測(cè)79個(gè)外顯子缺失和重復(fù)型突變的純合子和雜合子，靈敏度高，結(jié)果準(zhǔn)確可靠，是比熒光多重PCR技術(shù)更為高通量的DMD基因診斷技術(shù)，是目前DMD基因診斷中診斷效率最高的一種方法。 2、通過(guò)把依賴探針連接的多重?cái)U(kuò)增技術(shù)(MLPA)，短串聯(lián)重復(fù)序列多態(tài)位點(diǎn)(STR)連鎖分析，AmpFISTRIdentifiIerPCRAmplification，HLA-ABDRSSP和羊水