短發(fā)夾RNA干擾表達質粒與防粉已堿對大腸癌細胞LOVO-5-Fu多藥耐藥性逆轉作用的比較.pdf

1、目的:大腸癌是一種常見惡性腫瘤，大腸癌病死率在西方國家位于惡性腫瘤死亡的第3位，僅次于肺癌和乳腺癌，在我國占惡性腫瘤死因的第5位，且發(fā)病率呈逐年升高趨勢。早、中期大腸癌以手術治療為主，晚期及術后復發(fā)患者，其主要治療手段則為化療。但是目前化療療效并不樂觀，大腸癌化療療效顯著降低的主要原因之一是由于腫瘤多藥耐藥性(multidrug resistance，MDR)的產(chǎn)生，尤其是大腸癌細胞的MDR原發(fā)性高表達及繼發(fā)性高表達。MDR的特點是一旦

2、對某種化療藥物產(chǎn)生耐藥，則對結構、細胞作用靶點和作用機制均不同的抗癌藥物都可產(chǎn)生交叉、廣譜的耐藥現(xiàn)象[1]。本研究通過比較短發(fā)夾RNA(short hairpin RNA，shRNA)干擾表達質粒與防粉己堿(Tetrandrine，Tet)對大腸癌LOV0/5-Fu細胞株MDRlmRNA的表達、P-糖蛋白(P-glycoprotein，P-gp)的表達、對細胞周期和凋亡率的影響、以及對化療藥物敏感性的影響，探討shRNA干擾質粒和Tet

3、大腸癌LOV0/5-Fu耐藥細胞株的耐藥性的逆轉作用，以期找到一種逆轉策略能更好的逆轉腫瘤細胞的MDR，以指導臨床用藥。
　　 方法靶向MDR1的shRNA干擾質粒和Tet分別作用于人大腸癌多藥耐藥細胞株LOV0/5-Fu，噻唑藍(MTT)法檢測各組細胞對5-Fu的敏感性，流式細胞術檢測細胞周期變化、凋亡情況及P-糖蛋白(P-glycoprotein，P-gp)的表達，實時熒光定量PCR(Realtime-PCR)檢測各組細胞M

4、DRl mRNA的表達水平，Western blot檢測各組細胞P-gp的表達水平，并分析各組結果之間的差異。實驗結果用SPSS10.0統(tǒng)計軟件分析。
　　 結果:
　　 1、兩種干擾因素作用后細胞對5-FU敏感性的變化：轉染組[IC50=(2.38±0.45)mol/ml]比對照組[IC50=(7.27±0.34)mol/ml]的IC50顯著降低(P＜0.05)，相對逆轉率為72.7％;Tet作用組[IC50=(4.4

5、1±0.72)mol/ml]比對照組的IC50也明顯降低，(P＜0.05)，相對逆轉率42.5％。轉染組和Tet作用組均低于對照組對5-Fu的RI。表明shRNA干擾質粒轉染細胞和Tet作用后均在一定程度恢復耐藥細胞對化療藥物5-FU的敏感性，且shRNA干擾質粒對LOV0/5-Fu耐藥性的逆轉作用更強。
　　 2、細胞周期的變化：與對照組細胞相比，轉染組和Tet作用組細胞G1期增多(P＜0.05)，S期減少(P＜0.05)。提

6、示抑制MDR1的表達后，更多的細胞被阻滯在G1期，進入分裂期的細胞明顯減少，轉染組阻滯效果更明顯。
　　 3、各組細胞凋亡率的變化：對照組細胞的凋亡率為(1.32±0.47)％，轉染組細胞的凋亡率為(5.88±0.44)％，兩組凋亡率間差異有顯著性意義(P＜0.05)；Tet作用組細胞的凋亡率為(3.24±0.26)％，與對照組細胞的凋亡率間差異有顯著性意義(P＜0.05)；轉染組與Tet作用組細胞間的凋亡率差異有顯著性意義(P

7、＜0.05)。
　　 4、P-gp表達結果：轉染組細胞P-gp[(61.6±4.85)％]明顯低于對照組細胞的P-gp的表達率[(96.9±2.25)％]，差異具有統(tǒng)計學意義(P＜0.05)；Tet作用組細胞P-gp表達率為(76.6±3.62)％，明顯低于對照組細胞的P-gp的表達率，差異具有統(tǒng)計學意義(P＜0.05)。轉染組與Tet作用組細胞間的P-gp表達率差異有統(tǒng)計學意義(P＜0.05)。
　　 5、細胞MDR1

8、基因的表達：轉染組細胞的RQ(Relative Quantitation)值為(232.98±81.04)，與對照組細胞(1462.00±161.17)相比，MDR1表達量明顯降低，差異具有統(tǒng)計學意義(P＜0.05)；Tet作用組細胞的RQ值為(569.99±85.15)，與對照組組細胞相比，MDR1表達量明顯降低，差異具有統(tǒng)計學意義(P＜0.05)。轉染組細胞的RQ值小于Tet作用組細胞的RQ值，兩組之間比較差異有統(tǒng)計學意義(P＜0.

9、05)。
　　 6、Western blot檢測P-gp蛋白：轉染組與Tet作用組細胞的P-gp蛋白表達明顯低于對照組細胞。轉染組細胞的P-gp蛋白表達明顯低于Tet作用組細胞的P-gp蛋白表達。說明轉染靶向MDR1的shRNA干擾質粒和經(jīng)過Tet作用后均可在一定程度上降低LOV0/5-FU多藥耐藥細胞的P-gp蛋白表達，shRNA干擾質粒對P-gp的抑制強于Tet。
　　 結論:
　　 1、shRNA干擾質粒和