小鼠IFN-γ真核表達載體的構建和轉染小鼠腹腔巨噬細胞抗腫瘤效應研究.pdf

1、鄭州大學碩士學位論文小鼠IFN-γ真核表達載體的構建和轉染小鼠腹腔巨噬細胞抗腫瘤效應研究姓名：劉康棟申請學位級別：碩士專業(yè)：病理學與病理生理學指導教師：趙明耀;董子明20030501鄭州大學2 0 0 3 年碩士畢業(yè)論文 小鼠I F N —y 真核表達載體的構建和轉染鼠腹腔巨噬細胞抗腫癰效應研究I 類抗原的表達。因而可以促進T h 細胞與A P C 以及C T L 與靶細胞的識別及相互作用。I F N —Y 的表達對T h 。細胞的增殖

2、有抑制效應，但對T h 。細胞卻沒有此效應，這種差別可能與T h ．細胞缺失I F N - Y 受體鏈的信號轉導表達有關。此外I F N —Y對維持幼稚型T 細胞對I L —1 2 的反應是必需的。這有利于T h 。細胞的分化，從而增強腫瘤的特異性細胞免疫。I F N - Y 對N K 細胞有強的激活作用，激活的N K 細胞可以非特異性殺傷腫瘤細胞。I F N - Y 在激活巨噬細胞分泌T N F —Q 的同時，還可以上調(diào)腫瘤細胞T N

3、 F —n 受體的表達。增強T N F _ a 的抑瘤作用，能夠增強靶細胞對C T L 和N K 細胞的敏感性。早期將巨噬細胞體外活化后回輸?shù)襟w內(nèi)治療腫瘤的過程中，I F N —Y 和L P S常被用來作為巨噬細胞的體外活化因子。但由于體外培養(yǎng)的巨噬細胞吞噬活性喪失很快( 每小時約喪失3 ％) ，體外培養(yǎng)體內(nèi)回輸?shù)膽檬艿较拗?。治療效果不理想。本實驗構建了小鼠I F N —Y 的真核表達載體，并將此載體在體外轉染小鼠腹腔巨噬細胞，并在荷

4、瘤小鼠腹腔內(nèi)注射重組表達載體，觀察抗腫瘤效應。實驗方法：I ．小鼠I F N —Y 真核表達載體的構建：無菌收集小鼠脾臟淋巴細胞，培養(yǎng)于含1 0 ％胎牛血清的R 兩1 1 6 4 0 培養(yǎng)液中( i 0 0 u g ／m I P H A ) 培養(yǎng)4h 。1 0 0 0r p m 離心收集培養(yǎng)的細胞，按上海生工試劑盒方法提取總R N A 。設計兩套引物，采用R T —P c R 、巢式P C R 擴增提取的總R N A得到I F N —Y

5、 的c D N A ，將此c D N A 和p G E M - T 載體連接，用藍白篩選的方法初步篩選，用P C R 的方法進一步鑒定。將鑒定得到的重組質(zhì)粒進行擴增，雙酶切后回收目的片段和雙酶切的p c D N A 3 ．1 質(zhì)粒相連接，篩選得到重組的真核表達載體p c D N A 3 ，卜I F N —Y ，質(zhì)粒的提取、純化、感受態(tài)細胞制備、轉染、藍白篩選均參照《分子克隆實驗指南》進行。2 ．小鼠腹腔巨噬細胞的分離和培養(yǎng)：取2 0 克