Tau蛋白介導(dǎo)的細(xì)胞毒性及泛素連接酶Hrd1的保護(hù)作用.pdf

1、Tau 蛋白是神經(jīng)細(xì)胞特有的微管相關(guān)蛋白，其功能是與管蛋白結(jié)合形成微管(microtubulin，MT)，并維持其穩(wěn)定性。而異常的tau蛋白聚集是許多神經(jīng)退行性疾病共有的病理特征，這些疾病統(tǒng)稱為tau蛋白病(tauopathv)。在tau蛋白病中，tau被高度磷酸化并形成成對(duì)螺旋絲(paired helical filaments，PHFs)結(jié)構(gòu)，后者再聚集成神經(jīng)元纖維纏結(jié)(neurofibrillary tangles，NFTs)。T

2、au 在某些狀態(tài)下的代謝異?？赡苁莟au聚集的原因，因此消除或減少細(xì)胞內(nèi)非正常狀態(tài)的tau應(yīng)該是抑制tau的毒性和拯救細(xì)胞的可行策略。人類的Hrd1是新發(fā)現(xiàn)的一個(gè)內(nèi)質(zhì)網(wǎng)(endoplasmic reticulum，ER)膜定位的帶有指環(huán)結(jié)構(gòu)域(RING finger domain)的泛素連接酶(ubiquitin ligase，E3)，能介導(dǎo)其特異性底物蛋白的泛素化和降解。我們的前期研究發(fā)現(xiàn)，AD病人的皮質(zhì)和海馬神經(jīng)元內(nèi)有廣泛的Hrd1

3、表達(dá)，并且與異常磷酸化tau的聚集存在負(fù)相關(guān)。本研究在神經(jīng)和非神經(jīng)來源的細(xì)胞模型上，觀察了tau的過度表達(dá)和磷酸化對(duì)細(xì)胞形態(tài)、生長(zhǎng)及分化的影響，同時(shí)也觀察了 Hrd1 的表達(dá)對(duì)tau毒性的抑制作用，并初步探討了Hrd1介導(dǎo)細(xì)胞保護(hù)作用的相關(guān)機(jī)制。這不僅有助于進(jìn)一步認(rèn)識(shí)Hrd1的功能和tau蛋白病的病理機(jī)制，也為以Hrd1為靶點(diǎn)的藥物設(shè)計(jì)和篩選提供技術(shù)平臺(tái)。 目的： 觀察tau的過度表達(dá)和磷酸化對(duì)細(xì)胞的形態(tài)、生長(zhǎng)及分化的影

4、響，同時(shí)也觀察Hrd1的表達(dá)對(duì)tau毒性的抑制作用，并初步探討Hrd1介導(dǎo)細(xì)胞保護(hù)作用的相關(guān)機(jī)制。 方法： 構(gòu)建pEGFP-Cl-tau真核細(xì)胞表達(dá)質(zhì)粒。采用神經(jīng)(SH-SY5Y)和非神經(jīng)來源(293T)的細(xì)胞株，共轉(zhuǎn)染pEGFP-Cl-tau和表達(dá)野生型或酶失活型Hrd1等質(zhì)粒，用GSK-3p誘導(dǎo)tau過度磷酸化，熒光倒置顯微鏡和激光共聚焦顯微鏡觀察細(xì)胞形態(tài)的變化；MTT 法檢測(cè)細(xì)胞的增殖反應(yīng)；western blot

5、檢測(cè)相關(guān)蛋白的表達(dá)；免疫熒光雙標(biāo)記法觀察Hrd1和tau細(xì)胞內(nèi)的共定位等。 結(jié)果 1．Tau蛋白的過度表達(dá)和磷酸化對(duì)細(xì)胞形態(tài)，增殖與分化的影響采用SH-SY5Y和293T細(xì)胞，轉(zhuǎn)染pEGFP-Cl-tau質(zhì)粒和 pEGFP-Cl 空質(zhì)粒。熒光和共聚焦顯微鏡觀察發(fā)現(xiàn)瞬時(shí)轉(zhuǎn)染pEGFP-tau質(zhì)粒的細(xì)胞內(nèi)，少量的融合tau蛋白表達(dá)不影響細(xì)胞的形態(tài)和活性，但過度的tau蛋白表達(dá)對(duì)細(xì)胞有毒性作用，包括細(xì)胞突起消失，胞體變圓，細(xì)胞

6、內(nèi)tau蛋白聚集，甚至細(xì)胞凋亡；并且細(xì)胞分裂受阻，可出現(xiàn)雙核和多核，形成巨細(xì)胞。而穩(wěn)定表達(dá) tau 蛋白的細(xì)胞出現(xiàn)典型的凋亡特征：核固縮，體積縮小，核染色質(zhì)邊集，凝聚成大小不同的塊，胞膜皺縮或出泡。 共轉(zhuǎn)染表達(dá)tau和GSK-3p質(zhì)?；蛴脥徧锼?OA)誘導(dǎo)tau蛋白磷酸化后，細(xì)胞內(nèi)GFP-tau的熒光強(qiáng)度明顯增強(qiáng)，細(xì)胞形態(tài)更加異常。提示tau蛋白的過度表達(dá)對(duì)細(xì)胞有毒性作用，并且tau蛋白過度磷酸化后其毒性增加。 2．Hr

7、d1的表達(dá)抑制tau介導(dǎo)的細(xì)胞毒作用293T細(xì)胞共轉(zhuǎn)染表達(dá)tau和野生型Hrd1的質(zhì)粒，免疫熒光雙標(biāo)記結(jié)果發(fā)現(xiàn)，轉(zhuǎn)染Hrd1的細(xì)胞形態(tài)基本正常，貼壁良好。而單獨(dú)轉(zhuǎn)染pEGFP-Cl-tau質(zhì)粒的細(xì)胞胞體變圓，突起變短或消失，貼壁性差等。共聚焦顯微鏡觀察單個(gè)細(xì)胞內(nèi)，當(dāng)tau蛋白表達(dá)較少，Hrd1表達(dá)廣泛時(shí)，細(xì)胞形態(tài)相對(duì)正常；而當(dāng)細(xì)胞內(nèi)出現(xiàn)大量的tau蛋白表達(dá)時(shí)，Hrd1的表達(dá)減少，此時(shí)細(xì)胞形態(tài)異常甚至失去細(xì)胞輪廓。 細(xì)胞轉(zhuǎn)染后4～

8、5天，單獨(dú)轉(zhuǎn)染pEGFP-tau質(zhì)粒的細(xì)胞出現(xiàn)了典型的凋亡特征。而穩(wěn)定表達(dá)Hrd1和tau蛋白的細(xì)胞，形態(tài)相對(duì)正常，生長(zhǎng)狀態(tài)良好。提示Hrd1的表達(dá)能抑制 tau 蛋白介導(dǎo)的細(xì)胞毒性，促進(jìn)細(xì)胞存活。 3．Hrd1的細(xì)胞保護(hù)作用依賴于E3的活性293T細(xì)胞共轉(zhuǎn)染pEGFP-Cl-tau 和 pcDNA3.1-Hrd1ClA(泛素連接酶活性缺失的Hrd1突變體)質(zhì)粒，免疫熒光雙標(biāo)記結(jié)果發(fā)現(xiàn)，共轉(zhuǎn)染細(xì)胞內(nèi)tau蛋白表達(dá)量多，細(xì)胞形態(tài)更

9、加異常。共聚焦顯微鏡觀察單個(gè)細(xì)胞發(fā)現(xiàn)，雖然HrdClA與tau在細(xì)胞內(nèi)共定位，但不能阻止細(xì)胞形態(tài)的改變。而共轉(zhuǎn)染表達(dá)野生型Hrd1和tau質(zhì)粒的細(xì)胞，tau的表達(dá)明顯減少，細(xì)胞形態(tài)基本正常。提示Hrd1的細(xì)胞保護(hù)作用依賴于它的E3活性。 4．Hrd1能降低293T細(xì)胞內(nèi)tau的總體水平并且依賴于E3活性293T細(xì)胞共轉(zhuǎn)染pEGFP-tau和pCIneo-Hrd1(或pcDNA3.1-Hrd1ClA)質(zhì)粒，24h后熒光倒置顯微鏡觀

10、察，與單獨(dú)轉(zhuǎn)染pEGFP-tau的細(xì)胞相比，共轉(zhuǎn)染表達(dá)tau和野生型Hrd1質(zhì)粒的細(xì)胞內(nèi)GFP-tau熒光強(qiáng)度明顯減弱；共聚焦顯微鏡觀察發(fā)現(xiàn)，單個(gè)細(xì)胞內(nèi)Hrd1表達(dá)多的部位，tau的聚集明顯減少；而Hrd1ClA表達(dá)多的部位，tau的聚集無明顯變化。Western blot結(jié)果也證實(shí)：Hrd1能降低細(xì)胞內(nèi)tau蛋白的表達(dá)水平，而Hrd1ClA對(duì)tau蛋白的表達(dá)水平無明顯影響。提示Hrd1能降低293T細(xì)胞內(nèi)tau的總體水平并且依賴于E3

11、活性。 5．Hrd1能降低293T細(xì)胞內(nèi)磷酸化tau的水平293T細(xì)胞共轉(zhuǎn)染pcDNA3-GSK-3β和pEGFP-tau質(zhì)粒，western blot結(jié)果顯示GSK-3β呈劑量依賴性地誘導(dǎo)tau蛋白磷酸化，同時(shí)GSK-3β能增加細(xì)胞內(nèi) tau 蛋白的表達(dá)；Hrd1的表達(dá)能明顯降低細(xì)胞內(nèi)磷酸化tau蛋白的水平。提示Hrd1不僅能減少細(xì)胞內(nèi)tau蛋白的表達(dá)，也能降低磷酸化tau的水平。 結(jié)論： 以上研究結(jié)果提示ta