Tau蛋白介導的細胞毒性及泛素連接酶Hrd1的保護作用.pdf

1、Tau 蛋白是神經細胞特有的微管相關蛋白，其功能是與管蛋白結合形成微管(microtubulin，MT)，并維持其穩(wěn)定性。而異常的tau蛋白聚集是許多神經退行性疾病共有的病理特征，這些疾病統(tǒng)稱為tau蛋白病(tauopathv)。在tau蛋白病中，tau被高度磷酸化并形成成對螺旋絲(paired helical filaments，PHFs)結構，后者再聚集成神經元纖維纏結(neurofibrillary tangles，NFTs)。T

2、au 在某些狀態(tài)下的代謝異?？赡苁莟au聚集的原因，因此消除或減少細胞內非正常狀態(tài)的tau應該是抑制tau的毒性和拯救細胞的可行策略。人類的Hrd1是新發(fā)現(xiàn)的一個內質網(endoplasmic reticulum，ER)膜定位的帶有指環(huán)結構域(RING finger domain)的泛素連接酶(ubiquitin ligase，E3)，能介導其特異性底物蛋白的泛素化和降解。我們的前期研究發(fā)現(xiàn)，AD病人的皮質和海馬神經元內有廣泛的Hrd1

3、表達，并且與異常磷酸化tau的聚集存在負相關。本研究在神經和非神經來源的細胞模型上，觀察了tau的過度表達和磷酸化對細胞形態(tài)、生長及分化的影響，同時也觀察了 Hrd1 的表達對tau毒性的抑制作用，并初步探討了Hrd1介導細胞保護作用的相關機制。這不僅有助于進一步認識Hrd1的功能和tau蛋白病的病理機制，也為以Hrd1為靶點的藥物設計和篩選提供技術平臺。 目的： 觀察tau的過度表達和磷酸化對細胞的形態(tài)、生長及分化的影

4、響，同時也觀察Hrd1的表達對tau毒性的抑制作用，并初步探討Hrd1介導細胞保護作用的相關機制。 方法： 構建pEGFP-Cl-tau真核細胞表達質粒。采用神經(SH-SY5Y)和非神經來源(293T)的細胞株，共轉染pEGFP-Cl-tau和表達野生型或酶失活型Hrd1等質粒，用GSK-3p誘導tau過度磷酸化，熒光倒置顯微鏡和激光共聚焦顯微鏡觀察細胞形態(tài)的變化；MTT 法檢測細胞的增殖反應；western blot

5、檢測相關蛋白的表達；免疫熒光雙標記法觀察Hrd1和tau細胞內的共定位等。 結果 1．Tau蛋白的過度表達和磷酸化對細胞形態(tài)，增殖與分化的影響采用SH-SY5Y和293T細胞，轉染pEGFP-Cl-tau質粒和 pEGFP-Cl 空質粒。熒光和共聚焦顯微鏡觀察發(fā)現(xiàn)瞬時轉染pEGFP-tau質粒的細胞內，少量的融合tau蛋白表達不影響細胞的形態(tài)和活性，但過度的tau蛋白表達對細胞有毒性作用，包括細胞突起消失，胞體變圓，細胞

6、內tau蛋白聚集，甚至細胞凋亡；并且細胞分裂受阻，可出現(xiàn)雙核和多核，形成巨細胞。而穩(wěn)定表達 tau 蛋白的細胞出現(xiàn)典型的凋亡特征：核固縮，體積縮小，核染色質邊集，凝聚成大小不同的塊，胞膜皺縮或出泡。 共轉染表達tau和GSK-3p質?；蛴脥徧锼?OA)誘導tau蛋白磷酸化后，細胞內GFP-tau的熒光強度明顯增強，細胞形態(tài)更加異常。提示tau蛋白的過度表達對細胞有毒性作用，并且tau蛋白過度磷酸化后其毒性增加。 2．Hr

7、d1的表達抑制tau介導的細胞毒作用293T細胞共轉染表達tau和野生型Hrd1的質粒，免疫熒光雙標記結果發(fā)現(xiàn)，轉染Hrd1的細胞形態(tài)基本正常，貼壁良好。而單獨轉染pEGFP-Cl-tau質粒的細胞胞體變圓，突起變短或消失，貼壁性差等。共聚焦顯微鏡觀察單個細胞內，當tau蛋白表達較少，Hrd1表達廣泛時，細胞形態(tài)相對正常；而當細胞內出現(xiàn)大量的tau蛋白表達時，Hrd1的表達減少，此時細胞形態(tài)異常甚至失去細胞輪廓。 細胞轉染后4～

8、5天，單獨轉染pEGFP-tau質粒的細胞出現(xiàn)了典型的凋亡特征。而穩(wěn)定表達Hrd1和tau蛋白的細胞，形態(tài)相對正常，生長狀態(tài)良好。提示Hrd1的表達能抑制 tau 蛋白介導的細胞毒性，促進細胞存活。 3．Hrd1的細胞保護作用依賴于E3的活性293T細胞共轉染pEGFP-Cl-tau 和 pcDNA3.1-Hrd1ClA(泛素連接酶活性缺失的Hrd1突變體)質粒，免疫熒光雙標記結果發(fā)現(xiàn)，共轉染細胞內tau蛋白表達量多，細胞形態(tài)更

9、加異常。共聚焦顯微鏡觀察單個細胞發(fā)現(xiàn)，雖然HrdClA與tau在細胞內共定位，但不能阻止細胞形態(tài)的改變。而共轉染表達野生型Hrd1和tau質粒的細胞，tau的表達明顯減少，細胞形態(tài)基本正常。提示Hrd1的細胞保護作用依賴于它的E3活性。 4．Hrd1能降低293T細胞內tau的總體水平并且依賴于E3活性293T細胞共轉染pEGFP-tau和pCIneo-Hrd1(或pcDNA3.1-Hrd1ClA)質粒，24h后熒光倒置顯微鏡觀

10、察，與單獨轉染pEGFP-tau的細胞相比，共轉染表達tau和野生型Hrd1質粒的細胞內GFP-tau熒光強度明顯減弱；共聚焦顯微鏡觀察發(fā)現(xiàn)，單個細胞內Hrd1表達多的部位，tau的聚集明顯減少；而Hrd1ClA表達多的部位，tau的聚集無明顯變化。Western blot結果也證實：Hrd1能降低細胞內tau蛋白的表達水平，而Hrd1ClA對tau蛋白的表達水平無明顯影響。提示Hrd1能降低293T細胞內tau的總體水平并且依賴于E3

11、活性。 5．Hrd1能降低293T細胞內磷酸化tau的水平293T細胞共轉染pcDNA3-GSK-3β和pEGFP-tau質粒，western blot結果顯示GSK-3β呈劑量依賴性地誘導tau蛋白磷酸化，同時GSK-3β能增加細胞內 tau 蛋白的表達；Hrd1的表達能明顯降低細胞內磷酸化tau蛋白的水平。提示Hrd1不僅能減少細胞內tau蛋白的表達，也能降低磷酸化tau的水平。 結論： 以上研究結果提示ta