MANF對Aβ和tau蛋白過度磷酸化誘導的神經(jīng)細胞毒性的抑制作用.pdf

1、阿爾茨海默病(Alzheimer disease,AD)是一種漸進性神經(jīng)退行性疾病,又稱老年癡呆癥。促進AD發(fā)生發(fā)展的兩個主要致病因素是細胞外β淀粉樣蛋白(β-amyloid,Aβ)的沉積和細胞內(nèi)tau蛋白的過度磷酸化。Aβ來源于β淀粉樣前體蛋白(amyloidβ-protein precursor,APP),APP通過多種蛋白質(zhì)水解途徑進行加工,通過β-和γ-分泌酶作用途徑,產(chǎn)生 Aβ片段。當各種因素導致 Aβ空間構(gòu)象發(fā)生錯誤折疊轉(zhuǎn)變

2、成以β折疊為主時,就會導致蛋白質(zhì)聚集,難以被蛋白酶水解,從而在組織內(nèi)沉積并誘導神經(jīng)元凋亡甚至壞死。tau蛋白是一種微管結(jié)合蛋白,具有促進微管組裝并維持神經(jīng)元微管穩(wěn)定的作用。目前發(fā)現(xiàn)tau蛋白有6種異構(gòu)體和30多個絲氨酸或蘇氨酸磷酸化位點。在AD病理條件下,tau蛋白的這些位點發(fā)生異常磷酸化,過度磷酸化的tau進一步聚集并形成神經(jīng)元纖維纏結(jié)(neurofibrillary tangle,NFTs),使其失去與微管結(jié)合的能力,從而引起神經(jīng)細

3、胞的丟失,最終導致神經(jīng)退行性變。內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激(Endoplasmic Reticulum stress,ER Stress)現(xiàn)象存在于AD和帕金森病(Parkinson’s disease,PD)等神經(jīng)退行性疾病和腦缺血等其他神經(jīng)系統(tǒng)疾病中。在AD發(fā)病過程中,各種因素導致Aβ空間構(gòu)象發(fā)生錯誤折疊,轉(zhuǎn)變成以β折疊為主及磷酸化的tau增多時,導致蛋白質(zhì)聚集,從而誘發(fā)ER應(yīng)激反應(yīng)。MANF[Mesencephalic Astrocyte-der

4、ived Neurotrophic Factor,又名ARMET(Arginine rich, mutated in early stage of tumors)],是一種在ER應(yīng)激條件下特異性表達的蛋白質(zhì),在多種病理條件下發(fā)揮神經(jīng)保護作用。本課題組前期研究發(fā)現(xiàn),腦缺血可引發(fā)局部神經(jīng)元細胞中ER應(yīng)激從而誘導MANF基因高表達。在體外神經(jīng)元細胞培養(yǎng)實驗中, ARMET能促進神經(jīng)元細胞的增殖,抑制ER應(yīng)激誘導的細胞凋亡,重組MANF蛋白可抑

5、制衣霉素誘導的神經(jīng)細胞凋亡。目前發(fā)現(xiàn)MANF對大鼠帕金森氏病模型有保護作用,而MANF在AD中的相關(guān)功能目前尚未見報道。
　　目的:
　　本課題旨在觀察MANF是否可以抑制Aβ誘導的神經(jīng)細胞毒性作用和岡田酸誘導的N2a細胞中tau蛋白的過度磷酸化,以了解MANF神經(jīng)保護作用的機制。
　　方法:
　　構(gòu)建MANF基因過表達質(zhì)粒pCIneo-MANF-FLAG及針對MANF基因的siRNA質(zhì)粒pLentilox3.7

6、-MANF-siRNA。MANF基因的特異性siRNA序列為:sense:5’-GGA CCU CAA AGA CAG AGA UTT-3’,和antisense:5,-GCA GAU CGA CCU GAG CAC ATT-3’。表達和純化重組人MANF蛋白。進行原代神經(jīng)元細胞培養(yǎng)并經(jīng) NeuN染色鑒定,培養(yǎng)人來源的神經(jīng)母細胞瘤細胞株SH-SY5Y細胞和小鼠來源的神經(jīng)母細胞瘤細胞株N2a細胞,用Aβ誘導神經(jīng)毒性。用PI染色方法檢測死亡

7、的細胞,用細胞免疫熒光染色觀察Aβ誘導的原代神經(jīng)元細胞及SH-SY5Y細胞內(nèi)MANF、Bip/GRP78和Chop的表達。經(jīng)重組人MANF蛋白處理SH-SY5Y細胞后,或?qū)ANF過表達質(zhì)粒和siRNA質(zhì)粒轉(zhuǎn)染N2a細胞后,經(jīng)Aβ誘導,用MTT檢測法觀察SH-SY5Y和N2a細胞增殖活性變化,用TUNEL染色檢測N2a細胞轉(zhuǎn)染MANF相關(guān)質(zhì)粒后細胞凋亡情況,用免疫印跡法檢測N2a細胞轉(zhuǎn)染MANF相關(guān)質(zhì)粒后細胞蛋白的表達量。
　　結(jié)

8、果:
　　1.Aβ誘導神經(jīng)細胞毒性
　　將SH-SY5Y細胞培養(yǎng)至適當密度,用不同濃度的Aβ處理,以空白對照組和無血清試驗組作為對照,24hrs后用按照試劑說明書的操作步驟進行PI染色。在普通光鏡和熒光顯微鏡下觀察細胞死亡變化。與對照組相比,Aβ處理組,隨著Aβ濃度的逐漸增加,細胞死亡的數(shù)目量逐漸增多,該結(jié)果提示Aβ處理可以誘導神經(jīng)細胞死亡。
　　2.Aβ誘導神經(jīng)細胞發(fā)生ER應(yīng)激
　　為了觀察Aβ誘導的細胞死亡是

9、否由ER應(yīng)激介導,采用10μM的Aβ處理SH-SY5Y細胞,并用ER應(yīng)激誘導劑衣霉素(tunicamycin,TM,2.5μg/ml)作為陽性對照,同時檢測ER應(yīng)激的標志性蛋白CHOP/GADD153。結(jié)果發(fā)現(xiàn)Aβ可促進SH-SY5Y細胞中CHOP的表達。同樣,用10μM的Aβ處理原代培養(yǎng)的大鼠神經(jīng)元后,細胞中的BIP/GRP78、CHOP/GADD153表達增加。上述結(jié)果提示Aβ誘導的ER應(yīng)激可能是其細胞毒性的因素之一。
　　3

10、.Aβ上調(diào)MANF表達
　　在體外培養(yǎng)的SH-SY5Y細胞和原代培養(yǎng)的大鼠神經(jīng)元細胞中加入濃度為10μM的Aβ,然后用MANF抗體進行細胞免疫熒光檢測。結(jié)果發(fā)現(xiàn),Aβ可引起上述兩種細胞中MANF的表達明增加。
　　4.MANF對Aβ神經(jīng)毒性的抑制作用
　　4.1重組人MANF抑制Aβ的神經(jīng)毒性
　　用不同濃度的重組人MANF蛋白(0.5mg·L-1,1mg·L-1和2mg·L-1)處理SH-SY5Y細胞4hrs,

11、再用Aβ25-35(10μM)處理24 hrs,然后用MTT方法檢測細胞增殖活性。實驗結(jié)果顯示:重組人 MANF蛋白可劑量依賴性抑制Aβ25-35誘導的細胞死亡,且其作用隨時間的延長而增加。
　　4.2MANF過表達減弱Aβ的神經(jīng)毒性
　　在N2a細胞中轉(zhuǎn)染pCIneo-FLAG-MANF,轉(zhuǎn)染24hrs后給予不同濃度的Aβ處理(1.25μM、2.5μM、5μM、10μM、20μM)和經(jīng)10μM Aβ處理,在不同時間(4hr

12、s、8hrs、16hrs、24hrs、48hrs)進行MTT檢測。結(jié)果發(fā)現(xiàn)細胞內(nèi)過表達MANF蛋白可抑制Aβ引起的神經(jīng)毒性。
　　4.3沉默內(nèi)源性的MANF增加Aβ誘導的神經(jīng)毒性
　　在N2a細胞中轉(zhuǎn)染MANF的siRNA以沉默內(nèi)源性的MANF,在轉(zhuǎn)染24hrs后給予不同濃度的Aβ處理(1.25μM、2.5μM、5μM、10μM、20μM)和經(jīng)10μM Aβ處理,在不同時間(4hrs、8hrs、16hrs、24hrs、48h

13、rs)進行MTT檢測。結(jié)果發(fā)現(xiàn),干擾內(nèi)源性MANF可增強細胞對Ab毒性的敏感性。
　　5.MANF對Aβ誘導的細胞凋亡的抑制作用
　　在 N2a細胞中分別轉(zhuǎn)染 pCIneo-FLAG-MANF和pLentiLox3.7-MANF-siRNA質(zhì)粒及它們的對照質(zhì)粒,轉(zhuǎn)染24hrs后給予10μM的Aβ處理,然后進行TUNEL染色。結(jié)果發(fā)現(xiàn),過表達MANF能抑制Aβ誘導的細胞凋亡,而干擾內(nèi)源性MANF的表達可促進Aβ誘導的細胞凋亡。

14、同樣免疫印跡檢測也發(fā)現(xiàn)過表達MANF可以降低CHOP/GADD153和激活形式的Caspase-3的表達,沉默MANF后CHOP/GADD153和激活形式的Caspase-3的表達增加。以上結(jié)果提示,MANF可通過抑制ER應(yīng)激引起的細胞凋亡而抑制Aβ的神經(jīng)毒性。
　　6.MANF對tau蛋白過度磷酸化引起的細胞毒性抑制作用
　　6.1OA誘導的tau蛋白過度磷酸化
　　在體外培養(yǎng)的N2a細胞加入25nmol·L-1 O

15、A作用24hrs,然后用tau-5抗體和AT-8抗體分別對細胞內(nèi)總tau蛋白和磷酸化的tau蛋白水平進行檢測。結(jié)果發(fā)現(xiàn),OA處理后磷酸化的tau蛋白水平明顯增加,而總tau蛋白水平與對照組相比無明顯差異,上述結(jié)果提示OA能誘導tau蛋白的過度磷酸化。
　　6.2.重組人MANF預處理抑制OA誘導的tau蛋白過度磷酸化及細胞毒作用
　　在N2a細胞中預先加入不同濃度(1、2、4mg·L-1)重組人MANF蛋白處理4hrs后,再

16、經(jīng)25nmol·L-1 OA處理24hrs以誘導tau過度磷酸化,收集細胞,并用免疫印跡檢測蛋白質(zhì)的表達水平。用AT-8單克隆抗體檢測磷酸化的tau,GAPDH作為加樣對照。結(jié)果發(fā)現(xiàn),OA可誘導N2a細胞中tau蛋白的過度磷酸化,從而使細胞的增殖活性降低。重組人MANF蛋白(2,4mg·L-1)預處理N2a細胞均能抑制OA誘導的tau蛋白過度磷酸化,并能顯著提高細胞的增殖活性。
　　6.3.MANF的表達水平對OA誘導的tau過度

17、磷酸化及細胞毒的影響
　　在N2a細胞中轉(zhuǎn)染pcDNA3.1 vector、pCIneo-MANF-FLAG、pLentilox3.7 vector、pLentilox3.7-MANF-siRNA四種質(zhì)粒,按照Lipofectamine2000轉(zhuǎn)染試劑說明書進行轉(zhuǎn)染,轉(zhuǎn)染24 hrs后經(jīng)25nmol·L-1 OA誘導24hrs,收集細胞,蛋白用AT-8和GAPDH單克隆抗體進行檢測。結(jié)果發(fā)現(xiàn),MANF基因過表達可明顯抑制N2a細胞