泛素連接酶APC-C-Cdc20介導(dǎo)Zwint-1蛋白的降解.pdf

1、目的：
　　作為著絲粒重要組件，Zwint-1參與招募動(dòng)力蛋白激酶和動(dòng)力蛋白，促進(jìn)染色體運(yùn)動(dòng)或調(diào)控紡錘體檢查點(diǎn)，在著絲粒組裝和有絲分裂中期適當(dāng)沉默 SAC起到關(guān)鍵作用，以此確保染色體正確分離。通過進(jìn)一步實(shí)驗(yàn)，來(lái)考察Cdc20與 Zwint-1之間的關(guān)系，以及 D-box序列在這其中發(fā)揮的作用，為進(jìn)一步理解控制染色體分離的分子機(jī)制打下基礎(chǔ)。
　　方法：
　　經(jīng)PCR、雙酶切鑒定等一系列實(shí)驗(yàn)技術(shù)來(lái)構(gòu)建重組質(zhì)粒pCMV-my

2、c-Cdc20、pcDNA3-flag-Zwint-1、pcDNA3-flag-Zwint-1ΔD-box、pEGFP-Zwint-1和 pEGFP-Zwint-1ΔD-box；采用胸腺嘧啶雙阻斷法將HEK293T細(xì)胞同步化在 G1/S期，用流式細(xì)胞術(shù)通過碘化丙啶染色來(lái)確定細(xì)胞時(shí)相，用Western blot檢測(cè)Zwint-1蛋白在細(xì)胞周期的表達(dá)水平；使用放線菌酮和MG132處理細(xì)胞，經(jīng)Western blot檢測(cè)來(lái)觀察Zwint-1蛋

3、白在體內(nèi)的降解情況；對(duì)HEK293T細(xì)胞轉(zhuǎn)染了質(zhì)粒 pCMV-myc-Cdc20，即過表達(dá) hCdc20，做了Cdc20與 Zwint-1之間的免疫沉淀實(shí)驗(yàn)；過表達(dá) hCdc20和 RNA干擾 Cdc20，用Western blot來(lái)檢測(cè)內(nèi)源性Zwint-1蛋白質(zhì)水平；將分別編碼Zwint-1-flag、 Cdc20-myc和 Ub-HA的質(zhì)粒共轉(zhuǎn)染 HEK293T細(xì)胞，做了體內(nèi)泛素化分析；刪除了 Zwint-1的兩個(gè)D-box基序(1

4、28 RTQL131和203 RDKL206)，將突變序列亞克隆進(jìn)pcDNA3-flag，與質(zhì)粒pCMV-myc-Cdc20共轉(zhuǎn)染，用Western blot來(lái)檢測(cè)D-box缺失的Zwint-1蛋白質(zhì)水平。
　　結(jié)果：
　　Zwint-1蛋白水平隨細(xì)胞周期時(shí)相變化而變化；Zwint-1蛋白水平在用放線菌酮孵育8 h和16 h后顯著降低，在用MG132孵育6 h和12 h后蛋白水平迅速增加；免疫沉淀結(jié)果為陰性；過表達(dá) hCdc

5、20使 Zwint-1蛋白質(zhì)含量顯著減少；RNA干擾抑制Cdc20活性時(shí)Zwint-1蛋白和cyclin B顯著積累；當(dāng)過表達(dá)Cdc20-myc時(shí)，Zwint-1蛋白多泛素化水平顯著上升；缺乏D-box基序的Zwint-1不能被Cdc20識(shí)別降解。
　　結(jié)論：
　　Zwint-1的蛋白水平隨細(xì)胞周期出現(xiàn)周期性變化；Zwint-1通過 APC/C-Cdc20途徑泛素化降解；其機(jī)制是Cdc20識(shí)別Zwint-1的D-box基序。