龍須菜世代差異表達(dá)基因和泛素基因的克隆及功能分析.pdf

1、龍須菜已經(jīng)成為我國(guó)繼海帶和紫菜后的第三大栽培海藻，不僅是江蘺屬的一個(gè)重要的產(chǎn)瓊膠物種，而且還是一種遺傳學(xué)研究的好材料。因此，對(duì)龍須菜進(jìn)行基礎(chǔ)研究，具有重要意義。本論文構(gòu)建了龍須菜四分孢子體和雌配子問(wèn)正反向抑 制性消減雜交(SSH)文庫(kù)，分離了兩世代間差異表達(dá)的基因，并對(duì)其中若干基 因進(jìn)行了功能研究。 本研究選取正反向SSH文庫(kù)中各384個(gè)克隆進(jìn)行斑點(diǎn)雜交篩選，篩選出14個(gè)在兩世代間差異表達(dá)的基因，序列測(cè)定后提交到NCBI網(wǎng)站

2、上GenBank數(shù)據(jù)庫(kù)，序列登錄號(hào)為DQ008074-87。其中的7條序列分別與編碼小GTP結(jié)合蛋白(Small GTPase)即小G蛋白、天冬氨酸轉(zhuǎn)移酶、GMP合成酶、硫胺素焦磷酸化酶、R42蛋白和兩種未知功能蛋白有同源性，而其余7條序列沒(méi)有找到與其相匹配的基因。Virreal Northern雜交實(shí)驗(yàn)進(jìn)一步證實(shí)了14個(gè)基因中的11個(gè)在兩世代間呈現(xiàn)表達(dá)差異，其中7個(gè)是四分孢子體中上調(diào)表達(dá)的基因，3個(gè)在雌配子體中上調(diào)表達(dá)以及1個(gè)四分孢子

3、體特異表達(dá)的基因。 論文中選擇了SSH文庫(kù)中在雌配子體中上調(diào)表達(dá)的小G蛋白基因和一個(gè)在四分孢子體中特異表達(dá)的基因，進(jìn)行cDNA全長(zhǎng)序列的分離及功能分析。序列比對(duì)后發(fā)現(xiàn)，該龍須菜小G蛋白尤其與動(dòng)物來(lái)源的Rabll有較高的同源性。在小G蛋白基因的RACE反應(yīng)中，PCR擴(kuò)增出兩種小G蛋白基因轉(zhuǎn)錄物。測(cè)序后將二者與其基因組序列比較后發(fā)現(xiàn)，其中一個(gè)是mRNA前體加工過(guò)程中的中間體，另一個(gè)是成熟的mRNA，前者只剪切掉了一個(gè)內(nèi)含子，而在成熟

4、mRNA分子中 兩個(gè)內(nèi)含子均被剪切掉了。Rab基因的兩種轉(zhuǎn)錄物序列及其在基因組上的序列均提交到NCBI網(wǎng)站，GenBank序列登錄號(hào)分別為DQ062156、AY904354和DQ019225。Southem雜交結(jié)果表明該基因在龍須菜基因組中可能是單拷貝的。我們還利用兩種原核表達(dá)載體(融合表達(dá)載體pGEX和非融合表達(dá)載體 DBV220)，在大腸桿菌中表達(dá)了龍須菜小G蛋白，對(duì)融合重組表達(dá)產(chǎn)物進(jìn)行了抗原性及其抗血清的免疫特異性分析。結(jié)果表明該

5、重組蛋白具有很強(qiáng)的免疫原性和 免疫特異性。利用Western雜交技術(shù)對(duì)兩種表達(dá)產(chǎn)物進(jìn)行體外GTP結(jié)合性分析，實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明這兩種重組蛋白均具有GTP結(jié)合活性。我們還從文庫(kù)中選取了一個(gè)四分孢子體特異表達(dá)基因(克隆SSH466)，分離了cDNA全長(zhǎng)序列，GenBank 序列登錄號(hào)DQ019223。序列同源性分析表明，該基因是一個(gè)未知功能基因。蛋白模體分析表明陔基因編碼的多肽可能是一種內(nèi)在膜蛋白。 另外，我們還克隆了龍須菜融合泛素基因

6、、多聚泛素基因及多聚泛素基因的上游調(diào)控序列，并進(jìn)行了序列分析及兩基因在四分孢子體和雌配子體表達(dá)的初步研究。三條序列經(jīng)測(cè)定后提交到NCBI網(wǎng)站上GenBank數(shù)據(jù)庫(kù)，序列登錄號(hào)分別為DQ019224、AY957885和DQ333344。泛素基因序列及其氨基酸序列的比對(duì)結(jié)果表明，龍須菜融合泛素的保守性較多聚泛素差，但二者的進(jìn)化地位基本一致，紅藻多聚泛素基因內(nèi)部存在一定程度的趨同進(jìn)化。兩泛素基因在龍須菜雌配子體與四分孢子體中呈現(xiàn)出表達(dá)差異，融

7、合泛素基因在兩者的表達(dá)量相當(dāng)，而多聚泛素基因在前者的表達(dá)量較后者低很多，與減數(shù)分裂有關(guān)的生命活動(dòng)過(guò)程可能影響了多聚泛素基因的表達(dá)，使其表達(dá)呈現(xiàn)上調(diào)。多聚泛素基因上游調(diào)控序列分析結(jié)果表明該序列沒(méi)有內(nèi)含子。啟動(dòng)子預(yù)測(cè)結(jié)果表明在429-479bp處有一條可信度為1．OO的核心啟動(dòng)子。轉(zhuǎn)錄調(diào)控因子分析結(jié)果表明該序列有多種轉(zhuǎn)錄調(diào)控因子，主要是一些與脅迫條件相關(guān)，或是在某個(gè)特定發(fā)育階段調(diào)控表達(dá)的元件，其余還有一些是植物特有的，如在光控基因等的調(diào)控序