家蠶BmeIF4E基因的克隆、表達(dá)及功能分析.pdf

1、我們從本實(shí)驗(yàn)室構(gòu)建的家蠶蛹cDNA文庫(kù)中發(fā)現(xiàn)一條EST序列,在NCBI的GenBank數(shù)據(jù)庫(kù)中進(jìn)行比對(duì),結(jié)果發(fā)現(xiàn)該序列與其他物種的真核細(xì)胞翻譯起始因子4E基因具有較高的相似性,推測(cè)可能是編碼家蠶eIF4E蛋白的基因。然后通過(guò)RT-PCR技術(shù)從家蠶蛹中獲得該基因的全長(zhǎng)序列,并將該基因命名為.BmelF4E(Bombyx mori eukaryotic translationinitiation factor4E)基因,GenBank登錄號(hào)

2、為DN443192。生物信息學(xué)分析表明,該序列全長(zhǎng)1445bp,包含633bp組成的ORF框,編碼210個(gè)氨基酸殘基,等電點(diǎn)為5.97,預(yù)測(cè)分子量為24.44kD,并含有一個(gè)IF4E超家族保守結(jié)構(gòu)域。同源性比較結(jié)果表明該基因編碼蛋白質(zhì)的氨基酸序列與草地夜蛾(AF281654)的同源性達(dá)到91％。
　　 為研究23meIF4E的功能,將該基因克隆到大腸桿菌表達(dá)載體pET-28a(+)中,構(gòu)建原核表達(dá)質(zhì)粒pET-28a(+)-IBm

3、eIF4E,轉(zhuǎn)化感受態(tài)細(xì)胞E.coli BL21(DE3),篩選陽(yáng)性克隆,重組菌經(jīng)IPTG誘導(dǎo)后菌體裂解物利用SDS-PAGE檢測(cè),與陰性對(duì)照相比在28kD處有一特異性條帶。由于表達(dá)的融合蛋白既存在于上清中,也存在于沉淀中,因此利用菌體超聲破碎后的上清直接利用鎳親和柱純化融合蛋白。經(jīng)FPLC反相柱層析進(jìn)一步純化后,進(jìn)行質(zhì)譜分析,結(jié)果顯示該融合蛋白的分子量為27.87kD,與理論值28kD(融合標(biāo)簽3.56kD,BmeIF4E24.44k

4、D)基本相符。以純化所得蛋白為抗原免疫新西蘭兔制備多克隆抗體,ELISA檢測(cè)該抗體血清的效價(jià)大于1:12800。
　　 同時(shí),利用熒光定量PCR和Western blot的方法分析了不同發(fā)育時(shí)期及五齡幼蟲(chóng)各組織中BmeIF4E基因的表達(dá)差異,定量?jī)?nèi)參選用β-actin,結(jié)果顯示在卵、五齡幼蟲(chóng)、蛹和蛾四個(gè)發(fā)育時(shí)期中,蛾中的表達(dá)量最高,其次是蛹,再次是五齡幼蟲(chóng),而在卵中表達(dá)量很少;各組織中BmeIF4E表達(dá)量從高到底依次是馬氏管、表

5、皮、脂肪體、氣管、卵巢、中腸、頭和絲腺。以上研究結(jié)果表明,BmeIF4E作為一種重要的管家基因,在家蠶的整個(gè)生命周期中均起著非常重要的作用。家蠶Bm5細(xì)胞中進(jìn)行亞細(xì)胞定位研究結(jié)果表明BmeIF4E既存在于細(xì)胞質(zhì)中也存在于細(xì)胞核中。
　　 此外,以BmeIF4E基因的ORF為模板體外轉(zhuǎn)錄合成dsRNA,脂質(zhì)體包埋轉(zhuǎn)染Bm5細(xì)胞,72h后提取細(xì)胞總蛋白做Western blot檢測(cè)RNAi情況,發(fā)現(xiàn)干擾后細(xì)胞總蛋白中BmeIF4E蛋