E64d對活體缺氧缺血性腦損傷新生大鼠松果體的短期影響.pdf

1、目的：了解缺氧缺血性腦損傷(Hypoxic-ischemicbraindamage，HIBD)模型中松果體的損傷情況，了解凋亡、自噬及壞死相關蛋白的改變，初步探討E64d在HIBD后松果體損傷修復中的短期作用及可能機制。
　　 方法：采用7日齡新生SD(SpragueDawley)大鼠，根據改良Rice-Vannucci法建立HIBD模型。將新生大鼠隨機分為E64d干預組(E64d組)、不干預組(DMSO組)、假手術組（Sham

2、組），并選取HIBD后2h、6h、12h、24h、48h五個時間點，通過Westernblot法測定松果體Cleavedcaspase-3、Beclin-1、SpectrinαⅡ蛋白濃度的變化；采用HE染色及免疫組織化學法觀察松果體組織Cleavedcaspase-3、IL-21染色情況，從細胞層面了解松果體組織損傷情況并探討可能的機制。
　　 結果：1、Westemblot法提示：與Sham組比，DMSO組松果體細胞凋亡相關蛋

3、白Cleavedcaspase-3在6h明顯升高，12h達到高峰，至少持續(xù)至24h，到48h開始下降(P＜0.05)；與DMSO組比，E64d組Cleavedcaspase-3在6h、12h左右出現(xiàn)下降(P＜0.05)，但24h后已無統(tǒng)計學差異(P＞0.05)。免疫組化法提示：Cleavedcaspase-3在間質細胞及松果體細胞中均有表達，與Sham組比，DMSO組Cleavedcaspase-3在2h即表達明顯增強,48h時仍高(P

4、＜0.05)；與DMSO組比，E64d組2h表達Cleavedcaspase-3明顯下降(P＜0.05)，但48h已無作用(P＞0.05)。
　　 2、與Sham組比，DMSO組自噬相關蛋白Beclin-1升高，在6h的時候出現(xiàn)統(tǒng)計學差異，24h達到高峰，至少持續(xù)至48h仍存在明顯升高(P＜0.05)；與DMSO組比，E64d組松果體組織表達Beclin-1在24h出現(xiàn)顯著下降(P＜0.05)，其余時間點無統(tǒng)計學差異(P＞0.0

5、5)。
　　 3、與Sham組比，DMSO組松果體細胞質膜骨架蛋白SpectrinαⅡ分解增多，除6h點外，各時間點上均有明顯升高，高峰在12h左右(P＜0.05)；與DMSO組比，使用E64d在一定時間內減少了細胞骨架的分解，保護了質膜完整性，在12h、24h存在統(tǒng)計學意義(P＜0.05)，但之后壞死仍在上升,48h已無明顯差異(P＞0.05)。
　　 4、免疫組化顯示松果體組織細胞間質中存在IL-21,2h三組之間無

6、差別(P＞0.05)，與Sham組比，DMSO組表達的IL-21在48h的時候明顯升高(P＜0.05)；與DMSO組比，E64d組松果體IL-21顯著下降(P＜0.05)。
　　 結論：1、HIBD后松果體短期內出現(xiàn)細胞損傷，表現(xiàn)為核溶解及碎裂，部分細胞分界模糊，并且牽涉到凋亡、自噬及壞死三種形式。
　　 2、在本實驗中，腹腔注射E64d對HIBD后活體松果體有著直接的影響。對松果，體凋亡相關蛋白Cleavedcaspa