αvβ受體放射性配體99Tcm-TP1326的制備、鑒定及其動物體內實驗研究.pdf

1、研究背景及目的
　　 血管生成(angiogenesis)是指由多種因子共同參與，在原有血管網(wǎng)的基礎上通過內皮細胞芽生出新生血管的復雜過程，在腫瘤的生長、侵潤和轉移過程中發(fā)揮重要作用。其中，整合素在腫瘤組織新生血管內皮細胞的表達與腫瘤血管生成密切相關。
　　 整合素是細胞黏附分子家族的重要成員之一，是由一條α鏈和一條β鏈以非共價鍵鏈接而成的異二聚體，以跨膜蛋白形式廣泛分布于細胞表面，主要介導細胞與細胞、細胞與細胞外基質間

2、(extracellular matrix，ECM)的黏附。迄今已發(fā)現(xiàn)18種α亞單位和8種β亞單位，以及由不同亞單位組成的20余種整合素，其中整合素αvβ3(αvβ3受體)在介導血管內皮細胞與腫瘤細胞的黏附、參與腫瘤血管生成、促進腫瘤生長和轉移等方面發(fā)揮重要作用。αvβ3受體的表達具有一定特異性，它在成熟血管內皮細胞中很少表達，但在腫瘤組織新生血管內皮細胞和部分腫瘤細胞表面呈高水平表達，使其成為抑制腫瘤血管生成研究的新靶點。
　　

3、 研究發(fā)現(xiàn)，含精氨酸-甘氨酸-天冬氨酸(Arg-Gly-Asp，RGD)序列的小分子多肽是一類高效αvβ3受體拮抗劑，能夠選擇性抑制培養(yǎng)腫瘤細胞的增值和腫瘤組織的生長，其中含兩個二硫鍵的RGD多肽對腫瘤血管生成的抑制率最高。目前，用于治療惡性腫瘤的整合素抑制劑中，部分含RGD序列的小分子多肽已進入Ⅲ期臨床實驗。利用放射性核素標記含RGD序列的小分子多肽來實現(xiàn)αvβ3受體顯像及核素靶向治療已成為腫瘤分子核醫(yī)學的研究熱點之一。
　　

4、 本研究通過多肽化學合成技術對自行設計的環(huán)形RGD九肽(RGD-4CK)進行甘氨酸-丙氨酸(D)-甘氨酸-甘氨酸-γ氨基丁酸[GA(D)GG-Aba]修飾，探討99Tcm標記GA(D)GG-Aba-RGD-4CK(TP1326)的最佳條件、標記物的理化與生物學性質、正常動物體內示蹤動力學及組織動態(tài)分布特點、荷瘤裸鼠體內腫瘤顯像與競爭結合顯像，為以整合素αvβ3為靶點的受體顯像研究奠定基礎。
　　 研究方法
　　 1.9

5、9Tcm-TP1326的制備：化學合成制備TP1326，并以氯化亞錫為還原劑進行99Tcm標記，紙層析法測定標記率并計算比活度。
　　 2.99Tcm-TP1326的理化與生物學性質鑒定：通過體外穩(wěn)定性實驗、HPLC分析、血清蛋白結合實驗和油/水分配實驗，鑒定標記物的理化與生物學性質。
　　 3.健康大耳兔體內示蹤動力學實驗：取9只健康雄性大耳兔，經(jīng)耳緣靜脈注射200μ1(37 MBq)99Tcm-TP1326溶液，分別

6、于1.5、3、5、10、30、60、120、240、480 min從對側耳緣靜脈采血、稱重，γ計數(shù)儀測量放射性計數(shù)(cpm)，經(jīng)測量效率校正后計算血液放射性濃度(kBq/L)。通過藥代動力學分析軟件DAS3.1.0對房室模型進行綜合分析、判斷，得出最佳房室模型、擬合曲線及示蹤動力學參數(shù)。
　　 4.健康大耳兔SPECT顯像研究：將健康雄性大耳兔仰臥位固定于實驗臺上，探頭視野中心對準兔胸腹部。經(jīng)耳緣靜脈注射200μl(74 MBq

7、)99Tcm-TP1326溶液，立即以1幀/s采集1 min，1幀/min采集59 min，并于1.5、2、2.5、3、4h分別預置計時1.06 min、1.12 min、1.19 min、1.26 min、1.42 min采集1幀圖像，定性觀察各主要組織器官的放射性動態(tài)分布變化。
　　 5.健康小鼠體內分布實驗：將7.4 MBq標記物定容至500 ml，混勻后向5支放免試管中分別加入1 ml溶液，測量其放射性(cpm)，將放射

8、性計數(shù)平均數(shù)乘以500，即為參考源的放射性計數(shù)。按隨機數(shù)字表法將35只健康昆明小鼠分為7組，每組5只。經(jīng)尾靜脈注射標記溶液200μl(7.4 MBq)，分別于1、5、10、30、60、120、240 min處死，收集血液、心、肺、肝、腎、腸、肌肉、骨、腦，分別稱重并測量其放射性，經(jīng)參考源校正后計算每克組織百分注射劑量率(%ID/g)。繪制體內放射性分布圖。
　　 6.荷瘤裸鼠顯像研究：將荷人黑色素瘤B16裸鼠仰臥位固定，經(jīng)尾靜脈

9、注射標記溶液100μl(7.4 MBq)。分別于30、60、90、120、180及240 min經(jīng)時間衰減校正后各預置計時采集1幀，觀察荷瘤裸鼠體內腫瘤組織及其他組織器官放射性的動態(tài)分布變化，利用ROI技術測定腫瘤與對側軟組織的T/NT放射性比值。
　　 7.荷瘤裸鼠競爭結合顯像研究：基本實驗方法同上，不同的是先經(jīng)荷瘤裸鼠尾靜脈注射300倍非標記TP1326(100μg)，1h后注射標記多肽，觀察TP1326對腫瘤組織攝取99T

10、cm-TP1326的影響，評價標記多肽與腫瘤組織結合的特異性。
　　 結果
　　 1.99Tcm-TP1326的制備：化學合成TP1326的純度為97.31%，99Tcm-TP1326的標記率為(95.86±0.83)%，直接法計算其比活度為(38.62±0.32)TBq/mmol。
　　 2.理化與生物學性質鑒定：標記多肽室溫放置4h后，其放射化學純度(radiochemical purity，RCP)為(91

11、.76±2.75)%；TP1326的HPLC保留時間與99Tcm-TP1326的洗脫液放射峰值時間基本一致(約14 min)；Sephadex G50柱層析未見明顯蛋白結合放射峰；油/水分配系數(shù)為-(1.76±0.06)。
　　 3.健康大耳兔體內的示蹤動力學實驗：99Tcm-TP1326在健康兔體內動力學符合權重為1/c的二室模型，tl/2α、t1/2β分別為(3.115±0.771)min、(76.978±22.460)mi

12、n，清除率(CL)為(4.508±3.316)ml/min。
　　 4.健康大耳兔SPECT顯像研究：血池影消退迅速，放射性主要經(jīng)腎臟清除，腸道、胃區(qū)、頸部未見明顯放射性濃聚，腦呈低放射性本底影。
　　 5.健康小鼠體內分布實驗：注射后初期，標記多肽放射性主要分布于血液、心臟和肝臟，并隨時間迅速下降；腎臟放射性呈持續(xù)高水平；腸道放射性并未隨肝臟放射性降低而升高；肌肉、腦組織呈持續(xù)低放射性分布。
　　 6.荷瘤裸鼠

13、顯像研究：30 min腫瘤清晰顯影，1 h時腫瘤與肌肉的T/NT比值最高，約5.26。
　　 7.荷瘤裸鼠競爭結合顯像研究：注射顯像劑后1h，腫瘤影像明顯減淡，T/NT比值約2.83，抑制率約46.2％。
　　 結論
　　 1.本研究成功制備了標記率高(>95%)、穩(wěn)定性好的99Tcm-TP1326，標記方法簡便，常溫下即可完成，無需分離純化可直接應用，易于制備成一步法標記凍干試劑盒。
　　 2.99Tc