TNFR放射性配體99Tcm-TP1093的制備及其荷瘤動(dòng)物顯像研究.pdf

1、研究背景及目的:
　　腫瘤壞死因子α(TNFα,簡(jiǎn)稱TNF)是一種多功能細(xì)胞因子,由單核細(xì)胞、巨噬細(xì)胞或淋巴細(xì)胞分泌產(chǎn)生,在炎癥反應(yīng)、免疫調(diào)節(jié)、抗腫瘤、微生物與寄生蟲感染等方面起重要作用。TNF通過靶細(xì)胞膜表面TNF受體(TNFR)介導(dǎo)發(fā)揮其生物學(xué)功能。研究證實(shí),TNFR在包括惡性淋巴瘤、肝癌、結(jié)腸癌、乳腺癌、胰腺癌等多種惡性腫瘤細(xì)胞表面呈高水平表達(dá);重組改構(gòu)的人TNF(rmhTNF)在體內(nèi)、外能夠特異性殺傷腫瘤細(xì)胞,而對(duì)正常組織

2、細(xì)胞則無明顯的毒副作用,并已在國內(nèi)外用于臨床治療腫瘤。因此,TNFR是一潛在的腫瘤分子影像和生物治療研究的理想靶標(biāo)。
　　Thr-Ala-Gln-Ser-Ala-Tyr(TAQSAY)是通過噬菌體肽庫展示技術(shù)篩選得到的靶向TNFR1胞外區(qū)的高選擇性、高親和力六肽。分別在六肽的氨基末端和羧基末端添加丙氨酸(Ala)與甘氨酸(Gly)殘基,所得ATAQSAYG八肽能更好地模擬在相應(yīng)目標(biāo)噬菌體外殼表達(dá)的外源性插入的TAQSAY六肽構(gòu)像;

3、實(shí)驗(yàn)顯示,ATAQSAYG八肽能夠有效抑制培養(yǎng)的TNFR陽性腫瘤細(xì)胞增殖。
　　本課題擬通過化學(xué)修飾合成G(D)AGG-Aba-ATAQSAYG-NH2(TP1093),利用其中的G(D)AGG四肽作為雙功能螯合劑,實(shí)現(xiàn)對(duì)ATAQSAYG的99Tcm間接標(biāo)記,制備標(biāo)記率符合顯像要求的99Tcm-TP1093,探討其作為TNF受體陽性實(shí)體腫瘤分子顯像劑的可行性,拓展腫瘤分子影像研究的新途徑。
　　研究方法:
　　1.99

4、Tcm-TP1093的制備:化學(xué)合成G(D)AGG-Aba-ATAQSAYG-NH2(TP1093,純度98.81％),其中G(D)AGG為雙功能螯合劑。99Tcm標(biāo)記TP1093:雙蒸水溶解多肽,SnCl2作為還原劑,反應(yīng)體系為弱堿性(pH約為10),加入新鮮淋洗的99TcmO4-、充氮密封,室溫震蕩30min,反應(yīng)完成后加入NaH2PO4將標(biāo)記溶液pH調(diào)至中性。
　　2.99Tcm-TP1093理化性質(zhì)鑒定:①上行紙層析法測(cè)定

5、計(jì)算標(biāo)記率與比活度,并評(píng)價(jià)體外穩(wěn)定性,展開劑分別為氨水系統(tǒng)和丙酮;②人血清蛋白結(jié)合實(shí)驗(yàn),經(jīng)SephadexG-50柱層析,評(píng)價(jià)標(biāo)記多肽與血漿蛋白的結(jié)合能力;③脂/水分配實(shí)驗(yàn)評(píng)價(jià)標(biāo)記多肽的親脂/親水性。
　　3.健康家兔體內(nèi)顯像:經(jīng)耳緣靜脈注射99Tcm-TP1093,SPECT顯像定性觀察組織器官的放射性動(dòng)態(tài)分布變化,利用ROI技術(shù)分析重要組織器官的時(shí)間-放射性曲線(TAC)。
　　4.健康家兔體內(nèi)示蹤動(dòng)力學(xué)實(shí)驗(yàn):取家兔9只

6、,經(jīng)耳緣靜脈各注射200μl(74MBq)99Tcm-TP1093,分別于1.5、3、5、10、30、60、120、240、480min從對(duì)側(cè)耳緣靜脈采血、稱重,γ免疫計(jì)數(shù)儀測(cè)量放射性計(jì)數(shù)(cpm),經(jīng)參考標(biāo)準(zhǔn)源校正后計(jì)算血液放射性濃度(KBq/L)。應(yīng)用代謝動(dòng)力學(xué)軟件(DAS3.1.0版),對(duì)健康家兔體內(nèi)平均血液放射性濃度-時(shí)間數(shù)據(jù)分別進(jìn)行一、二、三室模型曲線擬合,結(jié)合實(shí)測(cè)值與擬合不同室模型計(jì)算值間的比較及TNFR在正常體內(nèi)的表達(dá)實(shí)際

7、,對(duì)房室模型進(jìn)行綜合分析判斷。
　　5.正常小鼠體內(nèi)分布實(shí)驗(yàn):30只昆明小白鼠隨機(jī)表法分6組,每組5只,每只經(jīng)尾靜脈注射0.1ml(7.4MBq)99Tcm-TP1093,分別于注射后1、10、30、60、120、240min按組將實(shí)驗(yàn)小鼠斷頸處死,取血及主要臟器組織,稱重并測(cè)量其放射性計(jì)數(shù)(cpm),經(jīng)參考源校正后計(jì)算每克組織攝取放射性活度占注入放射性總活度的百分?jǐn)?shù)(ID%/g)。
　　6.荷瘤裸鼠顯像及競(jìng)爭(zhēng)結(jié)合顯像:經(jīng)荷

8、瘤裸鼠尾靜脈注射99Tcm-TP1093100μl(7.4MBq),仰臥位固定于SPECT探頭下方進(jìn)行顯像,觀察荷瘤裸鼠體內(nèi)腫瘤組織及其他組織器官放射性的動(dòng)態(tài)分布變化,利用ROI技術(shù)測(cè)定腫瘤與對(duì)側(cè)軟組織的T/NT放射性比值。并用同樣的方法進(jìn)行TP1093與99Tcm-TP1093在荷瘤裸鼠體內(nèi)的競(jìng)爭(zhēng)結(jié)合顯像,觀察TP1093對(duì)腫瘤組織對(duì)99Tcm-TP1093攝取的影響,評(píng)價(jià)99Tcm-TP1093與腫瘤組織的TNFR結(jié)合特性。

9、　　實(shí)驗(yàn)結(jié)果:
　　1.標(biāo)記率與比活度:99Tcm-TP1093的標(biāo)記率為(97.18±0.9)%,比活度(15.9±0.6)TBq/mmol。
　　2.理化性質(zhì):標(biāo)記多肽室溫放置4h,99Tcm-TP1093的放化純度仍有(93.34±0.91)%;SephadexG-50柱層析,99Tcm-TP1093與血清蛋白無明顯結(jié)合;脂/水分配系數(shù)lgP為-(1.68±0.09)。
　　3.體內(nèi)示蹤動(dòng)力學(xué):99Tcm-TP1

10、093在健康家兔體內(nèi)的動(dòng)力學(xué)過程符合權(quán)重為1/c的二室模型,t1/2α為(2.68±0.54)min,t1/2β為(69.15±20.34)min,總清除率(CL)為(5.02±4.38)mL/kg。
　　4.正常小鼠體內(nèi)分布和健康家兔顯像:靜脈注射99Tcm-TP1093后,血液放射性清除迅速,軟組織放射性消退快;整個(gè)顯像過程胃區(qū)呈放射性缺損,甲狀腺區(qū)未見異常放射性濃聚,腦呈低放射性分布;體內(nèi)放射性主要經(jīng)泌尿系統(tǒng)排泄,少量通過肝

11、膽系統(tǒng)分泌。
　　5.荷瘤裸鼠SPECT顯像:注射后0.5h腫瘤清晰顯影,T/NT值為達(dá)5.14。注射非標(biāo)記多肽后,腫瘤影像明顯減弱,0.5hT/NT值為2.52,抑制率約為49%。
　　結(jié)論:
　　1.本研究成功制備標(biāo)記率高(97.18±0.9)%、穩(wěn)定性好的99Tcm-TP1093,標(biāo)記方法簡(jiǎn)便,常溫下即可完成,無需分離純化,易于制備成一步法標(biāo)記凍干試劑盒。
　　2.99Tcm-TP1093體內(nèi)外穩(wěn)定性好,具