生物鐘基因Bmall對(duì)腫瘤生長(zhǎng)及抗癌藥物作用的影響及機(jī)制.pdf

1、研究背景與目的：
　　 漫長(zhǎng)的生物進(jìn)化過(guò)程中,為了適應(yīng)自然界周而復(fù)始的周期變化,生物體從單細(xì)胞到高等動(dòng)植物以及人類(lèi)的所有生命活動(dòng)均形成按照一定規(guī)律運(yùn)行的、周期性的生命活動(dòng)現(xiàn)象,即生物節(jié)律。研究發(fā)現(xiàn)生物鐘系統(tǒng)的存在,不僅產(chǎn)生和調(diào)節(jié)生物節(jié)律,以適應(yīng)外界環(huán)境的影響和作用,它還是繼神經(jīng)、體液和免疫系統(tǒng)之后又一機(jī)體重要的調(diào)控系統(tǒng)。大量的研究表明,生物節(jié)律紊亂會(huì)引起各種疾病的發(fā)生。生物節(jié)律與腫瘤的發(fā)生發(fā)展有著密切的聯(lián)系:生物節(jié)律的紊亂會(huì)導(dǎo)致

2、腫瘤的發(fā)生率增高,促進(jìn)腫瘤的生長(zhǎng)。
　　 生物鐘基因(Circadian clock gene)調(diào)控著機(jī)體的生物節(jié)律,它是由一組能夠通過(guò)自身的表達(dá)調(diào)控和形成正負(fù)反饋通路而產(chǎn)生生物節(jié)律的基因。目前已知的生物鐘基因有:Per(Per1、Per2、Per3)、Bmal1、Clock、Cry(Cry1、Cry2)、CKIε基因等。生物鐘基因不僅調(diào)控生物節(jié)律的變化,同時(shí)與維持機(jī)體內(nèi)環(huán)境的穩(wěn)定有關(guān),從而可能影響腫瘤發(fā)生發(fā)展。
　　

3、本課題擬研究的Bmal1基因是哺乳動(dòng)物生物鐘的核心組件,編碼蛋白質(zhì)Bmal1,它與Clock同屬于bHLH-PAS結(jié)構(gòu)域轉(zhuǎn)錄因子家族,在反饋回路中起正調(diào)控作用。Bmal1/Clock二聚體與E-box相結(jié)合,從而對(duì)Per、Cry、Rev—Erbα起正調(diào)控作用,維持著機(jī)體正常的生物節(jié)律。
　　 生物鐘基因與腫瘤之間的關(guān)系近年來(lái)也逐步受到重視。其中對(duì)Per1、Per2研究較多,而B(niǎo)mal1開(kāi)始受到關(guān)注。Mullenders等研究發(fā)現(xiàn)

4、在抑制Bmal1的表達(dá)的情況下,人成纖維細(xì)胞在受到γ射線照射后,p21蛋白表達(dá)下調(diào),這是由于Bmal1沉默后p53激活其靶點(diǎn)p21的功能受到了抑制。但是另一項(xiàng)研究卻發(fā)現(xiàn)相反的情況,Bmal1基因敲除小鼠的正常肝細(xì)胞的p21基因呈失節(jié)律性的高表達(dá)。Matsuo等的研究顯示,在Clock基因突變小鼠,wee1的表達(dá)下調(diào),并進(jìn)一步證明Clock只有與Bmal1形成二聚體后才可以激活Wee1,進(jìn)而可能影響細(xì)胞周期調(diào)控。Bmal1基因敲除小鼠和C

5、lock基因突變小鼠對(duì)抗癌藥物——環(huán)磷酰胺的毒副反應(yīng)明顯增強(qiáng),小鼠的體重均比對(duì)照組呈明顯下降。但有關(guān)Bmal1的研究尚較欠缺,而且不全面,現(xiàn)有的資料尚不能明確Bmal1在腫瘤發(fā)生發(fā)展過(guò)程中到底起何種作用；另外Bmal1的畸變或缺失對(duì)抗癌藥物作用產(chǎn)生何種影響,也值得深入探討。
　　 本課題試圖探討作為主要生物鐘基因的Bmal1在腫瘤生長(zhǎng)中的作用,并研究其對(duì)抗癌藥物作用的影響及其機(jī)制。希望以此了解鐘基因,鐘控基因和鐘相關(guān)基因的調(diào)控及

6、與抗癌藥物治療的關(guān)系。
　　 方法與結(jié)果：
　　 1.沉默Bmal1基因的小鼠結(jié)腸癌C26細(xì)胞株的建立
　　 方法:構(gòu)建靶向于Bmal1的RNAi質(zhì)粒,慢病毒包裝,感染C26細(xì)胞,流式細(xì)胞儀分選陽(yáng)性細(xì)胞,RT-PCR、Western blot檢測(cè)細(xì)胞Bmal1干擾效果。
　　 結(jié)果:RT-PCR結(jié)果發(fā)現(xiàn)的C26_Bmal1 shRNA細(xì)胞的Bmal1 mRNA水平明顯抑制,而只轉(zhuǎn)染慢病毒空載體C26_Co

7、ntrol shRNA細(xì)胞Bmal1的mRNA水平?jīng)]有改變。Western Blot結(jié)果也顯示C26_Bmall shRNA細(xì)胞的Bmal1蛋白水平明顯抑制,而C26_Control shRNA細(xì)胞的Bmal1蛋白水平?jīng)]有改變。
　　 2.沉默Bmal1對(duì)細(xì)胞生長(zhǎng)的影響
　　 2.1沉默Bmal1在體外對(duì)細(xì)胞生長(zhǎng)的影響
　　 方法:取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期C26細(xì)胞、小鼠成纖維L929細(xì)胞以及小鼠原代小腸上皮細(xì)胞,繪制生長(zhǎng)曲

8、線。
　　 結(jié)果:
　　 1)C26細(xì)胞生長(zhǎng)明顯加快。在細(xì)胞生長(zhǎng)96h時(shí),C26 Control shRNA和C26_Bmal1 shRNA的OD值分別為0.78±0.16和1.18±0.03(均值±SD),Bmal1shRNA細(xì)胞較對(duì)照細(xì)胞生長(zhǎng)加快51.28％(p<0.05)；在細(xì)胞生長(zhǎng)120h時(shí),上述兩株細(xì)胞的OD值分別為0.76±0.15和1.00±0.13,Bmal1 shRNA細(xì)胞較對(duì)照細(xì)胞生長(zhǎng)加快28.39％

9、(p<0.05)。
　　 2)原代腸上皮細(xì)胞生長(zhǎng)明顯加快。在細(xì)胞生長(zhǎng)96h時(shí),轉(zhuǎn)染Control siRNA和Bmal1 siRNA腸上皮細(xì)胞的OD值分別為1.36±0.23和1.60±0.32(均值±SD),Bmal1 siRNA細(xì)胞較對(duì)照細(xì)胞生長(zhǎng)加快17.62％(p<0.05)；在細(xì)胞生長(zhǎng)120h時(shí),上述兩株細(xì)胞的OD值分別為0.83±0.12和1.10±0.15,Bmal1 siRNA細(xì)胞較對(duì)照細(xì)胞生長(zhǎng)加快36.36％(p

10、<0.05)。
　　 3)L929細(xì)胞生長(zhǎng)明顯加快。在細(xì)胞生長(zhǎng)96h時(shí),轉(zhuǎn)染Control siRNA和Bmal1siRNA的L929細(xì)胞的OD值分別為1.42±0.21和1.84±0.17(均值±SD),Bmal1siRNA細(xì)胞較對(duì)照細(xì)胞生長(zhǎng)加快29.85％(p<0.05)。
　　 2.2沉默Bmal1在體內(nèi)對(duì)細(xì)胞生長(zhǎng)的影響
　　 方法:將相同數(shù)目(2×106)的C26_Control shRNA和C26_Bm

11、al1 shRNA種植到BALB/c小鼠腋下,待腫瘤長(zhǎng)出后每3天測(cè)量腫瘤大小,繪制腫瘤生長(zhǎng)曲線。接種腫瘤約30天后處死小鼠,取腫瘤,稱(chēng)瘤重；取小鼠胸腺和脾臟,稱(chēng)重。
　　 結(jié)果:比較兩組小鼠腫瘤的大小,發(fā)現(xiàn)C26_Bmal1 shRNA組小鼠較對(duì)照組生長(zhǎng)明顯增快。腫瘤重量較對(duì)照組明顯增大,Control shRNA與Bmal1 shRNA組的瘤重分別為1.10±0.28和2.24±0.69克。接種Bmal1 shRNA細(xì)胞的小鼠

12、的胸腺指數(shù)較對(duì)照組明顯降低,有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(p<0.05)。
　　 3.沉默Bmal1對(duì)抗腫瘤藥物作用的影響
　　 方法:取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的C26_Control shRNA和C26_Bmal1 shRNA細(xì)胞,分別加入不同濃度的Docetaxel(DOC)和依托泊苷(VP-16),培養(yǎng)72h后,MTT法檢測(cè)細(xì)胞活性。
　　 結(jié)果:應(yīng)用DOC和VP-16后,沉默Bmal1的細(xì)胞較對(duì)照組細(xì)胞的IC50分別明顯升高159.

13、3％和69.3％,有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(p<0.05)。
　　 4.沉默Bmal1對(duì)細(xì)胞凋亡的影響
　　 4.1沉默Bmal1對(duì)C26細(xì)胞凋亡的影響
　　 方法:取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的C26_Control shRNA和C26_Bmal1 shRNA細(xì)胞,應(yīng)用PI/annexinⅤ雙染法檢測(cè)細(xì)胞凋亡。
　　 結(jié)果:對(duì)照組細(xì)胞凋亡率為3.1±0.2％,Bmal1沉默后細(xì)胞凋亡率為4.9±0.3％；應(yīng)用可誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡的抗癌藥

14、物VP-16,75μM和150μM作用24hr后,檢測(cè)細(xì)胞凋亡,結(jié)果發(fā)現(xiàn)C26_Control shRNA的凋亡率分別為24.6±7.5％、29.4±7.1％,而C26_Bmal1 shRNA的凋亡率分別為9.0±3.5％、11.2±5.3％,Bmal1沉默后細(xì)胞凋亡明顯減少,與對(duì)照組細(xì)胞C26_Control shRNA相比有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(p<0.05)。
　　 4.2沉默Bmal1對(duì)L929細(xì)胞凋亡的影響
　　 方法:

15、取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的L929細(xì)胞,利用脂質(zhì)體介導(dǎo)siRNA轉(zhuǎn)染法沉默Bmal1基因,應(yīng)用PI/annexinⅤ雙染法檢測(cè)細(xì)胞凋亡。
　　 結(jié)果:對(duì)照組和Bmal1沉默組的細(xì)胞凋亡率分別為15.9±1.8％、7.1±0.7％；應(yīng)用可誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡的抗癌藥物VP-16,75μM和150μM作用24hr后,檢測(cè)細(xì)胞凋亡,結(jié)果發(fā)現(xiàn)L929_Control siRNA的凋亡率分別為34.8±8.6％、39.9±7.2％,而L929_Bmal1 s

16、iRNA的凋亡率分別為11.3±3.3％、18.5±4.6％,Bmal1沉默后細(xì)胞凋亡明顯減少,有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(p<0.05)。
　　 5.沉默Bmal1對(duì)細(xì)胞周期的影響
　　 5.1沉默Bmal1對(duì)C26細(xì)胞周期的影響
　　 方法:取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的C26細(xì)胞,利用脂質(zhì)體介導(dǎo)siRNA轉(zhuǎn)染法沉默Bmal1基因,應(yīng)用PI染色法檢測(cè)細(xì)胞周期分布。在上述實(shí)驗(yàn)的基礎(chǔ)上,我們應(yīng)用細(xì)胞周期特異性藥物DOC,1μM、5μM作用于C

17、26_Bmal1 shRNA細(xì)胞與C26_ControlshRNA細(xì)胞48hr后,誘導(dǎo)細(xì)胞阻滯于G2/M期,應(yīng)用Pl染色法檢測(cè)細(xì)胞周期分布。
　　 結(jié)果:siRNA轉(zhuǎn)染法沉默Bmal1的C26細(xì)胞與對(duì)照組相比在G2/M期的分布降低約28.2％。C26_Bmal1 shRNA細(xì)胞與C26_Control shRNA細(xì)胞相比,不用藥組、DOC1μM組與DOC5μM組分別下降39.3％、25.1％和11.7％,均有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(p<0.

18、05)。
　　 5.2沉默Bmal1對(duì)L929細(xì)胞周期的影響
　　 方法:取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的L929細(xì)胞,利用脂質(zhì)體介導(dǎo)siRNA轉(zhuǎn)染法沉默Bmal1基因,應(yīng)用細(xì)胞周期特異性藥物DOC,2.5μM、5μM作用48hr后,誘導(dǎo)細(xì)胞阻滯于G2/M期,應(yīng)用PI染色法檢測(cè)細(xì)胞周期分布。
　　 結(jié)果:Bmal1沉默細(xì)胞與對(duì)照組細(xì)胞相比,不用藥組、DOC2.5μM組與DOC5μM組分別下降19.8％、7.6％和8.7％,均有統(tǒng)計(jì)

19、學(xué)差異(p<0.05)。
　　 6.沉默Bmal1基因?qū)?xì)胞DNA損傷修復(fù)的影響
　　 分別對(duì)C26細(xì)胞和L929細(xì)胞用順鉑處理24hr后,收集細(xì)胞,進(jìn)行單細(xì)胞凝膠電泳,熒光顯微鏡觀察,拍照,計(jì)數(shù)。利用CometScore分析軟件分析實(shí)驗(yàn)結(jié)果,統(tǒng)計(jì)DNA尾部百分含量(Tail DNA％,TD)和Olive尾矩(Olive tail momem,OTM)。
　　 實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)沉默Bmal1后,細(xì)胞的TD和OTM較對(duì)照組

20、明顯減少,顯示DNA損傷明顯減少。
　　 7.沉默Bmal1對(duì)生物鐘基因、細(xì)胞周期與凋亡調(diào)節(jié)基因表達(dá)的影響
　　 7.1沉默Bmal1基因?qū)26細(xì)胞生物鐘基因、細(xì)胞周期與凋亡調(diào)節(jié)基因表達(dá)的影響
　　 沉默Bmal1基因后,RT-PCR結(jié)果顯示,生物鐘基因per1、per2、per3基因表達(dá)下調(diào),cry1表達(dá)上調(diào),rev-erbα表達(dá)沒(méi)有明顯變化；細(xì)胞周期與凋亡調(diào)節(jié)基因wee1、p53、p21表達(dá)下調(diào)；c-myc

21、表達(dá)沒(méi)有明顯變化。
　　 7.2沉默Bmal1基因?qū)π∈笤c上皮細(xì)胞生物鐘基因、細(xì)胞周期與凋亡調(diào)節(jié)基因表達(dá)的影響
　　 沉默Bmal1基因后,RT-PCR結(jié)果顯示,生物鐘基因per1、per2、per3基因表達(dá)下調(diào),cry1、rev-erbα表達(dá)上調(diào)；細(xì)胞周期與凋亡調(diào)節(jié)基因wee1、p53表達(dá)下調(diào)；p21、c-myc表達(dá)上調(diào)。
　　 7.3沉默Bmal1基因?qū)929細(xì)胞生物鐘基因、細(xì)胞周期與凋亡調(diào)節(jié)基因表達(dá)的

22、影響
　　 沉默Bmal1基因后,RT-PCR結(jié)果顯示,生物鐘基因per1、per2、per3基因表達(dá)下調(diào),cry1表達(dá)上調(diào),rev-erbα表達(dá)沒(méi)有明顯變化；細(xì)胞周期與凋亡調(diào)節(jié)基因wee1、p53、p21表達(dá)下調(diào)；c-myc表達(dá)沒(méi)有明顯變化。
　　 8.沉默Bmal1對(duì)細(xì)胞周期調(diào)節(jié)蛋白表達(dá)的影響
　　 沉默Bmal1基因后,Western blot結(jié)果顯示,在C26細(xì)胞和L929細(xì)胞中,CDC2、cyclin

23、B1、cyclin D1、cyclinE的表達(dá)上調(diào),而wee1、cyclinA表達(dá)沒(méi)有明顯變化。
　　 結(jié)論：
　　 (1)用RNAi法沉默生物鐘基因Bmal1后,在體外可以促進(jìn)小鼠結(jié)腸癌細(xì)胞C26、小鼠成纖維細(xì)胞L929以及小鼠原代腸上皮細(xì)胞的增殖；在荷小鼠結(jié)腸癌C26小鼠中可以促進(jìn)腫瘤的生長(zhǎng)。
　　 (2)在C26、L929細(xì)胞沉默Bmal1基因后,通過(guò)下調(diào)生物鐘基因per1、per2、per3和抑癌基因p5

24、3、p21的表達(dá),使抗癌藥物VP-16誘導(dǎo)的細(xì)胞凋亡減少。
　　 (3)沉默Bmal1基因后,通過(guò)上調(diào)cdc2、cyclin B1、cyclinD1、cyclinE導(dǎo)致C26、L929細(xì)胞增殖加快,G2/M期分布減少；在應(yīng)用G2/M期阻滯藥Docetaxel后,G2/M期阻滯明顯減少。
　　 (4)在C26、L929細(xì)胞沉默Bmal1基因后,由抗癌藥物順鉑(DDP)誘導(dǎo)的細(xì)胞DNA損傷明顯減少。
　　 (5)生物