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文檔簡介
1、目的:
探討p53在青蒿琥酯抑制大鼠原代肝星狀細胞(HSCs)增殖及誘導其凋亡中的作用,初步揭示青蒿琥酯對HSCs的作用機理,為臨床應(yīng)用青蒿琥酯治療肝纖維化提供實驗依據(jù)。
方法:
健康Wistar大鼠經(jīng)25%烏拉坦腹腔注射麻醉后消毒,0.8mg/mL鏈霉蛋白酶50mL與0.5mg/mL膠原酶50mL灌流消化肝臟,細胞懸液經(jīng)8%、12%和18%Nycodenz密度梯度離心,于8%與12%的梯度界面獲取HSCs
2、,調(diào)整細胞密度為5×105/mL,接種于培養(yǎng)瓶中以含20%FBS的DMEM培養(yǎng)。倒置相差顯微鏡下觀察新鮮分離的細胞形態(tài)和生長特征,流式細胞術(shù)檢測細胞純度。傳代細胞制備細胞爬片,以抗desmin/FITC,抗GFAP/TRITC,DAPI染色分別標記結(jié)蛋白、膠質(zhì)纖維酸性蛋白和細胞核進一步鑒定HSCs。分離的大鼠肝星狀細胞于培養(yǎng)瓶中原代培養(yǎng)10d,使細胞處于培養(yǎng)活化狀態(tài)。HSCs分為實驗組和對照組,實驗組以不同濃度青蒿琥酯(終濃度分別為12
3、5、150、175、200、225μmol/L)作用24、48及72h。應(yīng)用四甲基偶氮唑鹽(MTT)法檢測細胞增殖率,消化法測定細胞培養(yǎng)上清液中羥脯氨酸(Hyp)濃度,比色法檢測細胞培養(yǎng)上清中乳酸脫氫酶(LDH)活性,流式細胞術(shù)PI單染檢測細胞周期,流式細胞術(shù)ArnnexinV-FITC/PI雙染和Hoechst33258熒光染色檢測細胞凋亡,Westernblotting及RT-PCR觀察各組細胞中p53表達的變化。
結(jié)果:
4、
(1)肝星狀細胞的分離培養(yǎng)與鑒定:倒置相差顯微鏡觀察新分離的HSCs呈球形,折光性強,懸浮于培養(yǎng)液中。培養(yǎng)10d后,HSCs已充分展開,細胞呈星形或多邊形,細胞內(nèi)顆粒明顯減少。剛分離出來的HSCs與抗desmin抗體結(jié)合,流式細胞儀檢測細胞純度,純度達95%以上。第二代HSCs抗desmin/FITC,抗GFAP/TRITC染色呈陽性,且陽性細胞數(shù)>99%。肝星狀細胞生長曲線顯示肝星狀細胞培養(yǎng)72h后開始增殖,第4、5天進入
5、對數(shù)生長期,第6、7天進入平臺期。
(2)青蒿琥酯對細胞增殖的影響:MTT比色結(jié)果顯示,不同濃度青蒿琥酯分別作用HSCs24、48、72h,與對照組比較,青蒿琥酯150,175,200,225μmol/L對HSCs的抑制率明顯增加,差異有統(tǒng)計學意義(P<0.01)。各治療組作用HSCs24和48h時其抑制作用隨濃度的增加而增加(P<0.01),提示青蒿琥酯抑制HSCs增殖呈濃度依賴性。175μmol/L組抑制作用隨作用時間的增
6、加而增加(P<0.01),其中72h時,150μmol/L組的抑制率已達92.6%,提示青蒿琥酯抑制HSCs增殖呈時間依賴性。
(3)細胞培養(yǎng)上清液中羥脯氨酸的檢測:青蒿琥酯作用24h后,各濃度組細胞分泌羥脯氨酸水平降低,與對照組比較,差異有統(tǒng)計學意義(P<0.01)。
(4)細胞培養(yǎng)上清中LDH的檢測:青蒿琥酯作用24h后,各濃度組細胞培養(yǎng)上清中LDH水平較低,與對照組比較,差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)。
7、> (5)青蒿琥酯對HSCs細胞周期的影響:青蒿琥酯175、200μmol/L組G0/G1期細胞所占百分率與對照組比較顯著上升(P<0.01),S期細胞所占百分率顯著下降(P<0.05),G2/M期細胞無明顯變化。
(6)青蒿琥酯對HSCs凋亡的影響:檢測結(jié)果發(fā)現(xiàn),隨著青蒿琥酯濃度的升高,其引起HSCs凋亡的數(shù)量呈現(xiàn)上升趨勢,對照組細胞凋亡率為(40.73±0.81)%,給藥組(青蒿琥酯濃度分別為150、175、200μmo
8、l/L)細胞凋亡率分別為(52.63±0.84)%、(63.97±0.50)%、(66.65±0.99)%,各給藥組與對照組比較,差異有統(tǒng)計學意義(P<0.01)。且隨著青蒿琥酯濃度的增加,HSCs的凋亡指數(shù)逐漸增加。但無青蒿琥酯作用時,HSCs有自發(fā)凋亡。Hoechst33258熒光染色結(jié)果顯示青蒿琥酯組的細胞核出現(xiàn)典型的凋亡形態(tài)學的改變,而對照組細胞核無凋亡形態(tài)學改變。
(7)Westernblotting及RT-PCR檢
9、測p53的表達:青蒿琥酯150、175、200μmol/L分別作用HSCs24h后,Westernblotting及RT-PCR檢測結(jié)果顯示,p53表達顯著增加,且隨著藥物濃度的增加而增加。
結(jié)論:
(1)大鼠原代肝星狀細胞分離培養(yǎng)成功。
(2)青蒿琥酯呈劑量和時間依賴性地抑制原代分離培養(yǎng)活化的HSCs增殖,從而使膠原蛋白的產(chǎn)生/分泌減少。
(3)青蒿琥酯抑制肝星狀細胞增殖的作用機制之一是增加P5
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