p53在青蒿琥酯誘導(dǎo)大鼠原代肝星狀細(xì)胞凋亡及抑制其增殖中的作用.pdf

1、目的:
　　探討p53在青蒿琥酯抑制大鼠原代肝星狀細(xì)胞(HSCs)增殖及誘導(dǎo)其凋亡中的作用，初步揭示青蒿琥酯對(duì)HSCs的作用機(jī)理，為臨床應(yīng)用青蒿琥酯治療肝纖維化提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。
　　方法:
　　健康Wistar大鼠經(jīng)25％烏拉坦腹腔注射麻醉后消毒，0.8mg/mL鏈霉蛋白酶50mL與0.5mg/mL膠原酶50mL灌流消化肝臟，細(xì)胞懸液經(jīng)8％、12％和18％Nycodenz密度梯度離心，于8％與12％的梯度界面獲取HSCs

2、，調(diào)整細(xì)胞密度為5×105/mL，接種于培養(yǎng)瓶中以含20％FBS的DMEM培養(yǎng)。倒置相差顯微鏡下觀察新鮮分離的細(xì)胞形態(tài)和生長(zhǎng)特征，流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)細(xì)胞純度。傳代細(xì)胞制備細(xì)胞爬片，以抗desmin/FITC，抗GFAP/TRITC，DAPI染色分別標(biāo)記結(jié)蛋白、膠質(zhì)纖維酸性蛋白和細(xì)胞核進(jìn)一步鑒定HSCs。分離的大鼠肝星狀細(xì)胞于培養(yǎng)瓶中原代培養(yǎng)10d，使細(xì)胞處于培養(yǎng)活化狀態(tài)。HSCs分為實(shí)驗(yàn)組和對(duì)照組，實(shí)驗(yàn)組以不同濃度青蒿琥酯(終濃度分別為12

3、5、150、175、200、225μmol/L)作用24、48及72h。應(yīng)用四甲基偶氮唑鹽(MTT)法檢測(cè)細(xì)胞增殖率，消化法測(cè)定細(xì)胞培養(yǎng)上清液中羥脯氨酸(Hyp)濃度，比色法檢測(cè)細(xì)胞培養(yǎng)上清中乳酸脫氫酶(LDH)活性，流式細(xì)胞術(shù)PI單染檢測(cè)細(xì)胞周期，流式細(xì)胞術(shù)ArnnexinV-FITC/PI雙染和Hoechst33258熒光染色檢測(cè)細(xì)胞凋亡，Westernblotting及RT-PCR觀察各組細(xì)胞中p53表達(dá)的變化。
　　結(jié)果:

4、
　　(1)肝星狀細(xì)胞的分離培養(yǎng)與鑒定：倒置相差顯微鏡觀察新分離的HSCs呈球形，折光性強(qiáng)，懸浮于培養(yǎng)液中。培養(yǎng)10d后，HSCs已充分展開，細(xì)胞呈星形或多邊形，細(xì)胞內(nèi)顆粒明顯減少。剛分離出來的HSCs與抗desmin抗體結(jié)合，流式細(xì)胞儀檢測(cè)細(xì)胞純度，純度達(dá)95％以上。第二代HSCs抗desmin/FITC，抗GFAP/TRITC染色呈陽性，且陽性細(xì)胞數(shù)>99％。肝星狀細(xì)胞生長(zhǎng)曲線顯示肝星狀細(xì)胞培養(yǎng)72h后開始增殖，第4、5天進(jìn)入

5、對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期，第6、7天進(jìn)入平臺(tái)期。
　　(2)青蒿琥酯對(duì)細(xì)胞增殖的影響：MTT比色結(jié)果顯示，不同濃度青蒿琥酯分別作用HSCs24、48、72h，與對(duì)照組比較，青蒿琥酯150，175，200，225μmol/L對(duì)HSCs的抑制率明顯增加，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)。各治療組作用HSCs24和48h時(shí)其抑制作用隨濃度的增加而增加(P<0.01)，提示青蒿琥酯抑制HSCs增殖呈濃度依賴性。175μmol/L組抑制作用隨作用時(shí)間的增

6、加而增加(P<0.01)，其中72h時(shí)，150μmol/L組的抑制率已達(dá)92.6％，提示青蒿琥酯抑制HSCs增殖呈時(shí)間依賴性。
　　(3)細(xì)胞培養(yǎng)上清液中羥脯氨酸的檢測(cè)：青蒿琥酯作用24h后，各濃度組細(xì)胞分泌羥脯氨酸水平降低，與對(duì)照組比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)。
　　(4)細(xì)胞培養(yǎng)上清中LDH的檢測(cè)：青蒿琥酯作用24h后，各濃度組細(xì)胞培養(yǎng)上清中LDH水平較低，與對(duì)照組比較，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。

7、>　　(5)青蒿琥酯對(duì)HSCs細(xì)胞周期的影響：青蒿琥酯175、200μmol/L組G0/G1期細(xì)胞所占百分率與對(duì)照組比較顯著上升(P<0.01)，S期細(xì)胞所占百分率顯著下降(P<0.05)，G2/M期細(xì)胞無明顯變化。
　　(6)青蒿琥酯對(duì)HSCs凋亡的影響：檢測(cè)結(jié)果發(fā)現(xiàn)，隨著青蒿琥酯濃度的升高，其引起HSCs凋亡的數(shù)量呈現(xiàn)上升趨勢(shì)，對(duì)照組細(xì)胞凋亡率為(40.73±0.81)％，給藥組(青蒿琥酯濃度分別為150、175、200μmo

8、l/L)細(xì)胞凋亡率分別為(52.63±0.84)％、(63.97±0.50)％、(66.65±0.99)％，各給藥組與對(duì)照組比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)。且隨著青蒿琥酯濃度的增加，HSCs的凋亡指數(shù)逐漸增加。但無青蒿琥酯作用時(shí)，HSCs有自發(fā)凋亡。Hoechst33258熒光染色結(jié)果顯示青蒿琥酯組的細(xì)胞核出現(xiàn)典型的凋亡形態(tài)學(xué)的改變，而對(duì)照組細(xì)胞核無凋亡形態(tài)學(xué)改變。
　　(7)Westernblotting及RT-PCR檢

9、測(cè)p53的表達(dá)：青蒿琥酯150、175、200μmol/L分別作用HSCs24h后，Westernblotting及RT-PCR檢測(cè)結(jié)果顯示，p53表達(dá)顯著增加，且隨著藥物濃度的增加而增加。
　　結(jié)論:
　　(1)大鼠原代肝星狀細(xì)胞分離培養(yǎng)成功。
　　(2)青蒿琥酯呈劑量和時(shí)間依賴性地抑制原代分離培養(yǎng)活化的HSCs增殖，從而使膠原蛋白的產(chǎn)生/分泌減少。
　　(3)青蒿琥酯抑制肝星狀細(xì)胞增殖的作用機(jī)制之一是增加P5