線粒體應(yīng)激與p53轉(zhuǎn)位誘導(dǎo)肝源細(xì)胞凋亡機(jī)制的研究.pdf

1、【背景】：
　　研究表明,酒精中毒性肝炎、病毒性肝炎、藥源性肝炎及肝癌等多種肝病都與氧化應(yīng)激有關(guān)。肝損傷的重要表現(xiàn)之一是發(fā)生肝細(xì)胞凋亡,研究肝細(xì)胞凋亡既是防治肝損傷的需要,也對(duì)誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞凋亡具有借鑒意義。P53作為重要的應(yīng)激傳感器,在ROS等不利因素的刺激作用下可誘導(dǎo)細(xì)胞發(fā)生凋亡。研究發(fā)現(xiàn),細(xì)胞一旦出現(xiàn)氧化應(yīng)激,p53就會(huì)大量表達(dá),啟動(dòng)細(xì)胞凋亡。但是,p53是通過(guò)哪些作用因素或途經(jīng)誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡的,目前尚不完全清楚。最近有研究發(fā)現(xiàn)

2、,在凋亡因子刺激下,p53可能轉(zhuǎn)位到線粒體發(fā)揮作用。而線粒體作為能量生產(chǎn)場(chǎng)所,也是自由基、活性氧(ROS)衍生的主要部位,同時(shí)又可能是ROS攻擊的主要靶點(diǎn)。然而,p53和線粒體以及細(xì)胞凋亡三者之間關(guān)系如何,至今仍然還是個(gè)“謎團(tuán)”。
　　葡萄糖氧化酶(GlucoseOxidase,GOX),能高度專一性地催化β-D-葡萄糖與細(xì)胞內(nèi)游離的氧反應(yīng),生成葡萄糖酸和過(guò)氧化氫(H2O2)。由于GOX的催化底物葡萄糖和氧氣在體內(nèi)含量豐富,葡萄糖

3、氧化酶催化ROS生成體系既是細(xì)胞內(nèi)存在的常見(jiàn)反應(yīng),也可以作為一個(gè)生理環(huán)境下H2O2釋放的理想模型。因此,采用GOX催化細(xì)胞內(nèi)β-D-葡萄糖以產(chǎn)生內(nèi)源性ROS,觀察p53和線粒體相關(guān)因子的變化,研究凋亡發(fā)生與調(diào)控過(guò)程,以期闡明p53參與誘導(dǎo)肝凋亡的可能機(jī)制,為肝損傷防治研究提供新的思路。
　　【目的】：
　　本項(xiàng)目通過(guò)葡糖糖氧化酶系統(tǒng)從體內(nèi)和體外水平誘導(dǎo)肝細(xì)胞產(chǎn)生氧化應(yīng)激,觀察細(xì)胞和線粒體中ROS水平變化;研究ROS是否能夠引

4、起線粒體膜通道孔開(kāi)放與膜電位改變,以及誘導(dǎo)p53的線粒體轉(zhuǎn)位;探討p53、線粒體應(yīng)激和肝源細(xì)胞凋亡的關(guān)聯(lián)性。具體研究目的如下:
　　1.觀察是否存在線粒體應(yīng)激和p53線粒體轉(zhuǎn)位,并探討二者間的關(guān)聯(lián)性。
　　2.研究線粒體氧化應(yīng)激過(guò)程中線粒體膜通透性和膜電位的變化。
　　3.探討線粒體應(yīng)激條件下p53參與肝源細(xì)胞凋亡的調(diào)控過(guò)程。
　　【方法】：
　　以HepG2細(xì)胞(人肝癌細(xì)胞)和Babl/c小鼠為研究對(duì)象,

5、實(shí)驗(yàn)分為:(A)正常對(duì)照組、(B)GOX處理組、(C)PFT+GOX組、(D)CsA+GOX組。研究肝細(xì)胞線粒體氧化應(yīng)激,線粒體膜結(jié)構(gòu)與功能破壞,p53表達(dá)和亞細(xì)胞定位及凋亡相關(guān)分子變化。同時(shí)采用p53抑制劑(Pifithrin-a,PFT)與線粒體膜通道孔抑制劑(CyclosporineA,CsA),進(jìn)一步觀察p53對(duì)線粒體氧化應(yīng)激、線粒體膜的功能及凋亡相關(guān)因子的抑制作用;深入研究線粒體應(yīng)激與p53線粒體轉(zhuǎn)位參與調(diào)控細(xì)胞凋亡機(jī)制。

6、r>　　1.細(xì)胞水平實(shí)驗(yàn):采用HepG2細(xì)胞系作為實(shí)驗(yàn)對(duì)象,利用葡萄糖+葡萄糖氧化酶ROS生成系統(tǒng)。采用免疫熒光和亞細(xì)胞蛋白免疫印跡法,研究ROS對(duì)肝細(xì)胞p53蛋白含量和亞細(xì)胞定位的影響。測(cè)定線粒體中超氧陰離子自由基清除劑MnSOD表達(dá),并使用Mito-SOXTM為探針測(cè)定線粒體ROS的生成。測(cè)定線粒體膜電位,線粒體膜通透性改變,線粒體細(xì)胞色素c釋放,研究線粒體功能改變。提取線粒體、細(xì)胞質(zhì)和細(xì)胞核,從整體和亞細(xì)胞水平分析細(xì)胞或組織中凋亡

7、相關(guān)蛋白,如細(xì)胞色素c、bax、caspase3、caspase9、p53蛋白水平變化,以及氧化還原蛋白MnSOD變化。探討氧化應(yīng)激、p53水平、線粒體結(jié)構(gòu)功能及肝源細(xì)胞凋亡之間的關(guān)系。
　　2.動(dòng)物水平實(shí)驗(yàn):在完成細(xì)胞學(xué)研究的基礎(chǔ)上,采用Balb/C小鼠作為研究對(duì)象,通過(guò)小鼠尾靜脈射葡萄糖氧化酶,誘導(dǎo)小鼠肝臟的急性氧化損傷,并通過(guò)尾靜脈給予Pifithrin-α和CyclosporineA處理,生理鹽水作為對(duì)照。主要觀察指標(biāo)如下

8、:處理完成后,取出小鼠肝組織,測(cè)定氧化還原、p53蛋白定位、膜損傷、細(xì)胞凋亡等指標(biāo)的的變化,測(cè)定方法與細(xì)胞實(shí)驗(yàn)一致。
　　【結(jié)果】：
　　(1)給予一定劑量葡萄糖氧化酶處理后,HepG2細(xì)胞活力明顯降低,細(xì)胞內(nèi)ROS、MDA水平升高和GSH含量降低。MnSOD蛋白表達(dá)水平降低,Mito-SOXTM染色后線粒體超氧陰離子自由基水平顯著升高,線粒體出現(xiàn)了氧化應(yīng)激狀態(tài)。
　　(2)GOX處理后HepG2細(xì)胞p53表達(dá)水平明顯

9、升高,p53大量向線粒體聚集,與以往文獻(xiàn)報(bào)道不同的是細(xì)胞核和細(xì)胞漿內(nèi)p53水平無(wú)明顯變化。
　　(3)GOX處理后線粒體膜電位降低和膜通透性轉(zhuǎn)運(yùn)孔開(kāi)放,細(xì)胞色素c由線粒體釋放至細(xì)胞質(zhì)中,Bax也由細(xì)胞漿向線粒體聚集,caspase-9、caspase-3激活。而AnnexinV/PI雙染和TUNEL陽(yáng)性率增加,表明大量細(xì)胞凋亡。
　　(4)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)表明,葡萄糖氧化酶導(dǎo)致小鼠肝細(xì)胞線粒體MDA和ROS水平升高,GSH水平降低。

10、尤其是p53水平上調(diào)并伴有線粒體轉(zhuǎn)位,抗氧化酶MnSOD表達(dá)與活性降低,肝細(xì)胞大量凋亡。
　　(5)給予p53抑制劑PFT(Pifithrin-α)和線粒體膜通道孔開(kāi)放抑制劑CsA(CyclosporineA)處理均可以一定程度上抑制HepG2細(xì)胞和小鼠肝臟p53的轉(zhuǎn)位,修復(fù)或減輕線粒體應(yīng)激損傷,細(xì)胞凋亡也明顯減輕。
　　【結(jié)論】：
　　(1)發(fā)現(xiàn)內(nèi)源性ROS誘導(dǎo)肝細(xì)胞凋亡的調(diào)節(jié)因子p53蛋白,并不是像文獻(xiàn)報(bào)道的那樣在

11、細(xì)胞核發(fā)揮作用,而是通過(guò)轉(zhuǎn)位到線粒體發(fā)揮關(guān)鍵調(diào)控作用。
　　(2)發(fā)現(xiàn)線粒體膜通透性改變和即膜電位下降可能是引起p53出現(xiàn)線粒體轉(zhuǎn)位的重要途徑;而轉(zhuǎn)位到線粒體的p53通過(guò)調(diào)控MnSOD表達(dá)影響線粒體氧化應(yīng)激。
　　(3)發(fā)現(xiàn)p53可能通過(guò)兩條途徑誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡:一方面p53調(diào)控線粒體氧化應(yīng)激,導(dǎo)致線粒體膜電位降低和膜通透性轉(zhuǎn)運(yùn)孔開(kāi)放,促進(jìn)了細(xì)胞色素c由線粒體釋放至細(xì)胞質(zhì)中,同時(shí)激活caspase-9、caspase-3;另一方