吡咯喹啉醌對谷氨酸損傷神經元的保護作用及機制研究.pdf

1、目的：
　　1.觀察吡咯喹啉醌（PQQ）對體外培養(yǎng)海馬神經元谷氨酸損傷的保護作用，并初步探討其作用機制。
　　2.觀察 PQQ對谷氨酸腦內注射大鼠模型神經元損傷的保護作用，并分析其作用機制。
　　方法：
　　1.體外培養(yǎng)胚胎大鼠海馬神經元，神經元特異性染色（MAP2）鑒定神經元純度；通過CCK-8法檢測不同濃度PQQ（12.5μM、25μM、50μM、100μM）對正常培養(yǎng)海馬神經元細胞活力的影響。
　　2

2、.建立原代培養(yǎng)的海馬神經元谷氨酸急性損傷模型（125μM，15 min），通過細胞形態(tài)觀察和CCK-8法，觀察PQQ對谷氨酸損傷海馬神經元形態(tài)和細胞活力的影響。
　　3.通過Hoechst33342和TUNEL染色，觀察PQQ對谷氨酸損傷海馬神經元凋亡的影響。
　　4.通過Western blot和Caspase-3酶活性檢測，觀察PQQ對谷氨酸損傷海馬神經元凋亡相關蛋白Bcl-2和Bax蛋白表達及凋亡相關蛋白酶Caspas

3、e-3活性的影響。
　　5.鈣離子熒光探針Fluo-4/AM標記海馬神經元，激光共聚焦顯微鏡下檢測PQQ對谷氨酸誘導的Ca2+內流的影響。
　　6.通過TMRM染色，檢測PQQ對谷氨酸誘導的海馬神經元線粒體膜電位改變的影響。
　　7.通過活性氧（ROS）、超氧化物歧化酶（SOD）、還原型谷胱甘肽（GSH）、丙二醛（MDA）和一氧化氮（NO）分析，觀察 PQQ對谷氨酸損傷神經元氧自由基生成及清除的影響。
　　8.通

4、過線粒體氧化呼吸鏈不同復合物的抑制劑應用，尋找PQQ在線粒體自由基清除中可能的作用靶點。
　　9.通過Western blot檢測Akt、GSK3β、JNK和P38蛋白磷酸化水平的表達變化，并加入相應通路抑制劑，觀察各抑制劑對PQQ保護功能的影響，尋找PQQ保護作用相關的信號轉導途徑。
　　10.通過免疫熒光化學觀察PQQ對谷氨酸損傷海馬神經元Nrf2表達定位的影響，實時定量PCR檢測PQQ對轉錄因子和抗氧化基因（Nrf1、

5、Nrf2、HO-1、GCLC）的表達影響，并觀察PI3K抑制劑的影響作用。
　　11.構建谷氨酸腦內注射模型，TUNEL檢測PQQ在體內對大腦皮層神經細胞凋亡的影響，FCM分析PQQ對谷氨酸腦內注射大鼠皮層細胞ROS生成的影響，并檢測SOD、GSH和MDA活性及含量的變化。
　　12.通過實時定量PCR和Western blot檢測PQQ對谷氨酸腦內注射大鼠皮層細胞轉錄因子和抗氧化基因（Nrf1、Nrf2、HO-1、GCLC

6、）表達及磷酸化 GSK3β表達的影響。
　　結果：
　　1.原代培養(yǎng)的海馬神經元純度較高，達95％以上，0~100μM濃度范圍內PQQ對正常培養(yǎng)的神經元細胞活力沒有顯著影響。
　　2. PQQ對谷氨酸損傷的海馬神經元具有保護作用，能抑制細胞活力的下降和減少細胞凋亡的產生，并呈現劑量依賴效應，在濃度為100μM時作用最佳。
　　3. PQQ能調節(jié)谷氨酸損傷海馬神經元中凋亡相關蛋白Bcl-2和Bax的比例，降低凋亡蛋

7、白酶Caspase-3的活性。
　　4. PQQ能穩(wěn)定線粒體膜電位，減少谷氨酸誘導的Ca2+內流。
　　5. PQQ通過抑制谷氨酸損傷神經元中ROS的生成及增加ROS的清除，減少氧化應激損傷。
　　6.線粒體復合物I、III和IV抑制劑能增加海馬神經元中ROS的生成，PQQ能減少復合物I和III抑制劑誘導的ROS增加，提示其作用靶點可能位于復合物I和III。
　　7. PQQ能維持谷氨酸損傷神經元中Akt的持續(xù)活

8、化并激活其下游GSK3β信號，同時抑制JNK信號的激活。使用PI3K抑制劑可以阻斷PQQ對神經元的保護作用及對凋亡蛋白比例的調節(jié)。
　　8. PQQ能促進Nrf2的核轉位和表達，增加下游ARE依賴抗氧化基因HO-1和GCLC的表達，這種作用可以被PI3K抑制劑所抑制。
　　9. PQQ對谷氨酸腦內注射大鼠具有保護作用，可以減少注射周圍皮層細胞凋亡的發(fā)生和降低大腦皮層細胞ROS的含量。
　　10. PQQ能促進谷氨酸腦內

9、注射大鼠大腦皮層內Nrf2、HO-1和GCLC的表達，增加磷酸化GSK3β的表達，這可能與其保護功能相關。
　　結論：PQQ對體外培養(yǎng)的海馬神經元谷氨酸損傷具有保護作用，能調節(jié)凋亡相關蛋白的比例及蛋白酶活性從而抑制細胞凋亡的發(fā)生。PQQ在體內也能拮抗谷氨酸誘導的大腦皮層細胞凋亡。PQQ的保護作用可能與穩(wěn)定線粒體功能、減少Ca2+超載、降低 ROS損傷和增加抗氧化基因的表達相關。PI3K/Akt/GSK3β信號途徑的活化在PQQ的保