應(yīng)激狀態(tài)下的星形膠質(zhì)細(xì)胞對(duì)神經(jīng)元對(duì)抗谷氨酸神經(jīng)毒性作用.pdf

1、目的：星形膠質(zhì)細(xì)胞在神經(jīng)系統(tǒng)有許多重要的作用.其中,中風(fēng)后對(duì)神經(jīng)元起保護(hù)作用是其功能之一. 在本實(shí)驗(yàn)中,模擬腦損傷后重要的危害因素之一的高谷氨酸狀態(tài)在體外純星形膠質(zhì)細(xì)胞培養(yǎng)中的作用,觀察星形膠質(zhì)細(xì)胞對(duì)谷氨酸誘導(dǎo)的神經(jīng)元損傷的保護(hù)作用極其可能機(jī)理. 材料和方法:分別體外培養(yǎng)單純神經(jīng)元和神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞;在神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞培養(yǎng)基內(nèi)加入谷氨酸,將刺激后的條件培養(yǎng)基應(yīng)用于純神經(jīng)元細(xì)胞培養(yǎng)基中,用Alamar Blue法檢測(cè)神經(jīng)元的死亡情況;應(yīng)用

2、分光光度法測(cè)定加入谷氨酸后星形膠質(zhì)細(xì)胞培養(yǎng)基內(nèi)丙酮酸的濃度,以及外源性給予神經(jīng)元丙酮酸觀察其對(duì)抗谷氨酸毒性作用;高壓液相色譜法檢測(cè)谷氨酸作用后神經(jīng)元內(nèi)谷胱甘肽的相對(duì)值;用reall-timeRTPCR檢測(cè)加入丙酮酸的神經(jīng)元內(nèi)谷胱甘肽合成限速酶GCSmRNA表達(dá)情況. 結(jié)果：用400μM谷氨酸處理過30min,洗去后,再用初始神經(jīng)元細(xì)胞培養(yǎng)液(無星形膠質(zhì)細(xì)胞培養(yǎng)基)培養(yǎng)24hr后,神經(jīng)元細(xì)胞的平均細(xì)胞抑制率是39.66±2.59﹪

3、.用相同劑量谷氨酸處理神經(jīng)元細(xì)胞30min后,并換上按各種比例混合的培養(yǎng)基(條件神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞培養(yǎng)基占培養(yǎng)基總量比) (12.5﹪,25﹪,50﹪,75﹪,100﹪),培養(yǎng)24hr后,神經(jīng)元細(xì)胞的細(xì)胞抑制率下降至20.60±7.76﹪,3.13±1.22﹪,3.80±2.06﹪,10.05±2.08﹪,7.82±5.0﹪,與單純用谷氨酸的神經(jīng)元細(xì)胞抑制率相比,均低于對(duì)照組P<0.01;當(dāng)谷氨酸加入到不含有丙酮酸的神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞培養(yǎng)基后,丙酮

4、酸的濃度迅速增至0.203±0.009EM.其峰值大約在30和60min(0.225±0.016和0.200±0.008mM).然后,在360min內(nèi),丙酮酸的濃度下降至0.090±0.022mM; 當(dāng)谷氨酸作用時(shí)及以后給予外源性丙酮酸后,某些濃度丙酮酸(1mM)能使神經(jīng)元細(xì)胞的細(xì)胞抑制率下降(8.69±5.87﹪).但不是所有濃度的丙酮酸都有這個(gè)作用.低濃度的丙酮酸(0.2,0.5mM)不能保護(hù)神經(jīng)元(p=0.14,0.13);Rea

5、l-time定量RT-PCR,通過每組樣本的熒光閾值數(shù)據(jù),檢測(cè)到在谷氨酸和丙酮酸處理過的樣本中,其神經(jīng)元內(nèi)GCS mRNA逐漸增加,較對(duì)照組高2.48±0.36.谷氨酸單獨(dú)作用組增加約1.13±0.46,但丙酮酸單獨(dú)作用組反而較未處理時(shí)下降.30min內(nèi),丙酮酸和谷氨酸處理組,谷氨酸、丙酮酸單獨(dú)處理組較對(duì)照組增高約1.46±0.25,0.03±0.46,1.40±0.22(p<0.05);用谷氨酸處理過的神經(jīng)元內(nèi)內(nèi)源性GSH的量較對(duì)照組

6、略下降.盡管單獨(dú)用外源性丙酮酸可以增加胞內(nèi)GSH,但只有1.2倍.但當(dāng)在谷氨酸處理時(shí)加入丙酮酸并維持30min后,GSFI的水平較對(duì)照組升至兩倍左右.BSO(0.1mM)作用過24hr的神經(jīng)元細(xì)胞存活率為93.99±1.96﹪(p<0.05).單純加入低濃度的丙酮酸(1,2.5 mM)無毒性作用,但加入丙酮酸和BSO混合物后,細(xì)胞大量死亡(細(xì)胞抑制率為87.16±3.16﹪,78.97±2.15﹪,p<0.005).處理后3hr內(nèi),幾乎