韌帶成纖維細(xì)胞成骨分化過(guò)程microRNA、mRNA和蛋白表達(dá)譜分析.pdf

1、強(qiáng)直性脊柱炎(ankylosing spondylitis,AS)是一種慢性進(jìn)行性炎癥疾病,是脊柱關(guān)節(jié)病(spondyloarthritides,SpA)的一種,主要侵犯脊椎關(guān)節(jié)與附近的肌腱、韌帶等軟組織,炎癥后繼發(fā)纖維化與鈣化,使脊椎逐漸失去柔軟度,嚴(yán)重時(shí)會(huì)發(fā)展到像“竹節(jié)”一樣無(wú)法彎曲或伸展[1]。骶髂關(guān)節(jié)炎癥和骶髂、脊柱關(guān)節(jié)強(qiáng)直是強(qiáng)直性脊柱炎典型的病理變化[1]。該病患者的病理特征性改變是韌帶附著端病(enthesopathy),病

2、變?cè)l(fā)部位是韌帶和關(guān)節(jié)囊等關(guān)節(jié)周圍軟組織[3]。本研究取強(qiáng)直性脊柱炎患者的韌帶,原代培養(yǎng)韌帶成纖維細(xì)胞,以腰椎滑脫韌帶成纖維細(xì)胞作為對(duì)照,用含地塞米松、抗壞血酸和β-磷酸甘油的誘導(dǎo)培養(yǎng)液誘導(dǎo)韌帶成纖維細(xì)胞向成骨細(xì)胞分化,發(fā)現(xiàn)到第14天成纖維細(xì)胞表達(dá)堿性磷酸酶,骨鈣素,并能形成大量礦化結(jié)節(jié),且AS患者的韌帶成纖維細(xì)胞骨鈣素的表達(dá)程度強(qiáng)于對(duì)照成纖維細(xì)胞。芯片檢測(cè)韌帶成纖維細(xì)胞向成骨細(xì)胞分化0天,7天,14天韌帶成纖維細(xì)胞microRNA和m

3、RNA表達(dá)譜的變化,數(shù)據(jù)分析發(fā)現(xiàn),和未誘導(dǎo)前相比,miR-29b在正常韌帶成纖維細(xì)胞成骨分化第7天上調(diào)1.73倍,在成骨分化第14天上調(diào)1.51倍,western blot實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)TGFβ3在成骨分化過(guò)程中表達(dá)下調(diào),與文獻(xiàn)報(bào)道[8]的其在間充質(zhì)細(xì)胞向成骨細(xì)胞分化過(guò)程中上調(diào)的結(jié)果一致,表明我們實(shí)驗(yàn)方法的可行性,表明TGFβ通過(guò)Smad3來(lái)降低Runx2蛋白的表達(dá)和活性或者通過(guò)Smurf來(lái)介導(dǎo)Runx2降解,從而抑制成骨分化過(guò)程。本研究分為

4、四個(gè)部分：
　　 第一章：韌帶成纖維細(xì)胞的原代培養(yǎng)及誘導(dǎo)成骨分化。
　　 目的：原代培養(yǎng)強(qiáng)直性脊柱炎患者的韌帶成纖維細(xì)胞,并用含地塞米松、抗壞血酸和b-磷酸甘油的誘導(dǎo)培養(yǎng)液誘導(dǎo)其向成骨細(xì)胞分化。
　　 方法：取強(qiáng)直性脊柱炎患者的韌帶組織后,膠原酶消化法原代培養(yǎng)獲得韌帶成纖維細(xì)胞,取第三代細(xì)胞,用含地塞米松(10nM)、抗壞血酸(50μg/ml)和β-磷酸甘油(10mM)的誘導(dǎo)培養(yǎng)液誘導(dǎo)其向成骨細(xì)胞分化,堿性磷酸酶

5、顯色試劑盒觀察堿性磷酸酶的表達(dá)情況,RT-PCR檢測(cè)骨鈣素,RUNX2的表達(dá)情況,茜素紅染色觀察礦化結(jié)節(jié)的形成情況。
　　 結(jié)果：成功培養(yǎng)出強(qiáng)直性脊柱炎患者的韌帶成纖維細(xì)胞,經(jīng)地塞米松、抗壞血酸和b-磷酸甘油的誘導(dǎo),堿性磷酸酶顯色試劑盒觀察到基質(zhì)成熟期堿性磷酸酶開(kāi)始表達(dá),RT-PCR檢測(cè)到骨鈣素,RUNX2的表達(dá),茜素紅染色觀察到礦化結(jié)節(jié)的形成。
　　 結(jié)論：成功培養(yǎng)出韌帶成纖維細(xì)胞,并在誘導(dǎo)培養(yǎng)液的誘導(dǎo)下表達(dá)成骨細(xì)胞表

6、型。
　　 第二章：韌帶成纖維細(xì)胞成骨分化過(guò)程microRNA和mRNA表達(dá)譜的檢測(cè)。
　　 目的：尋找強(qiáng)直性脊柱炎患者的韌帶成纖維細(xì)胞在成骨分化過(guò)程中差異表達(dá)的microRNA和mRNA。
　　 方法：取誘導(dǎo)分化0天,7天,14天的韌帶成纖維細(xì)胞,分別提取microRNA和mRNA,分別用CIfRYTM LNA芯片和NimbleGen芯片檢測(cè)差異表達(dá)的microRNA和mRNA,生物信息學(xué)分析差異表達(dá)的micr

7、oRNA和mRNA。
　　 結(jié)果：與誘導(dǎo)前相比,強(qiáng)直性脊柱炎患者的韌帶成纖維細(xì)胞成骨分化過(guò)程第7天有130個(gè)microRNA和801個(gè)mRNA表達(dá)上調(diào),679個(gè)microRNA和1527個(gè)mRNA表達(dá)下調(diào);成骨分化第14天有306個(gè)microRNA和1153個(gè)mRNA表達(dá)上調(diào),490個(gè)microRNA和1125個(gè)mRNA表達(dá)下調(diào);和正常的韌帶成纖維細(xì)胞相比,有61個(gè)microRNA和2537個(gè)mRNA表達(dá)上調(diào),82個(gè)microR

8、NA和1166個(gè)mRNA表達(dá)下調(diào);其中,miR-1246在成骨分化第7天上調(diào)1.48倍,成骨分化第14天上調(diào)3.69倍;miR-31*在成骨分化第7天下調(diào)0.30倍,在成骨分化第14天下調(diào)0.06倍。
　　 結(jié)論：通過(guò)對(duì)韌帶成纖維細(xì)胞進(jìn)行microRNA和mRNA表達(dá)譜分析,我們找出了大量差異表達(dá)的microRNA和mRNA,數(shù)據(jù)初步分析發(fā)現(xiàn)差異表達(dá)的基因除涉及BMPs、Wnt、Hedgehog及Notch等信號(hào)通路,還存在其他

9、差異表達(dá)顯著的microRNA和mRNA未見(jiàn)其與間充質(zhì)細(xì)胞成骨分化功能有關(guān)的報(bào)道,表明韌帶成纖維細(xì)胞的成骨分化過(guò)程可能還存在新的機(jī)制,這為我們進(jìn)一步研究成骨分化機(jī)制奠定了基礎(chǔ)。
　　 第三章：韌帶成纖維細(xì)胞成骨分化過(guò)程蛋白表達(dá)譜的分析。
　　 目的：尋找強(qiáng)直性脊柱炎患者的韌帶成纖維細(xì)胞在成骨分化過(guò)程中差異表達(dá)的蛋白。
　　 方法：取誘導(dǎo)分化0天,7天,14天的強(qiáng)直性脊柱炎患者的韌帶成纖維細(xì)胞,提取總蛋白,雙向電泳

10、技術(shù)分離蛋白,質(zhì)譜分析差異表達(dá)的蛋白。
　　 結(jié)果：與誘導(dǎo)前相比,強(qiáng)直性脊柱炎患者的韌帶成纖維細(xì)胞成骨分化過(guò)程第7天有10個(gè)蛋白表達(dá)上調(diào),20個(gè)蛋白表達(dá)下調(diào),成骨分化第14天有7個(gè)蛋白表達(dá)上調(diào),23個(gè)蛋白表達(dá)下調(diào)。經(jīng)質(zhì)譜鑒定發(fā)現(xiàn)20個(gè)差別比較明顯的點(diǎn),經(jīng)Mascot Search軟件分析,發(fā)現(xiàn)差異表達(dá)的蛋白有腫瘤壞死因子α誘導(dǎo)的蛋白、NF-kappa-B抑制劑相互作用Ras樣蛋白、AnnexinA2和淋巴細(xì)胞侵入和轉(zhuǎn)移誘導(dǎo)蛋白2

11、等。
　　 結(jié)論：通過(guò)對(duì)韌帶成纖維細(xì)胞進(jìn)行蛋白表達(dá)譜分析,我們發(fā)現(xiàn)了腫瘤壞死因子α誘導(dǎo)的蛋白、NF-kappa-B抑制劑相互作用Ras樣蛋白和Splicing factor,proline-andglutamine-rich等蛋白表達(dá)下調(diào),T淋巴細(xì)胞侵入和轉(zhuǎn)移誘導(dǎo)蛋白2、Cysteinedesulfurase和Poly(A)polymerase gamma等蛋白表達(dá)上調(diào),為后續(xù)研究奠定了基礎(chǔ)。
　　 第四章：miR-31

12、*及miR-29b在成纖維細(xì)胞礦化中的變化及靶基因驗(yàn)證。
　　 目的：生物信息學(xué)分析找出差異表達(dá)的microRNA、mRNA和蛋白,qRT-PCR和westernblot驗(yàn)證差異表達(dá)的microRNA和蛋白。
　　 方法：利用Agilent Gene Spring GX11.0軟件對(duì)差異表達(dá)的microRNA、mENA進(jìn)行生物信息學(xué)分析,microRNA和mRNA表達(dá)譜數(shù)據(jù)結(jié)合microRNA.org-targets a

13、ndexpression軟件(http://www.microma.org/)及TargetScanHuman5.1軟件(http://www.targetscan.org/)預(yù)測(cè)差異表達(dá)microRNA的靶基因,并分別用qRT-PCR和western blot驗(yàn)證。
　　 結(jié)果：和誘導(dǎo)前相比,韌帶成纖維細(xì)胞成骨分化過(guò)程中miR-21、miR-125b、miR-432及miR-31*表達(dá)明顯下調(diào),miR-1246和miR-29b