韌帶成纖維細胞成骨分化過程microRNA、mRNA和蛋白表達譜分析.pdf

1、強直性脊柱炎(ankylosing spondylitis,AS)是一種慢性進行性炎癥疾病,是脊柱關(guān)節(jié)病(spondyloarthritides,SpA)的一種,主要侵犯脊椎關(guān)節(jié)與附近的肌腱、韌帶等軟組織,炎癥后繼發(fā)纖維化與鈣化,使脊椎逐漸失去柔軟度,嚴重時會發(fā)展到像“竹節(jié)”一樣無法彎曲或伸展[1]。骶髂關(guān)節(jié)炎癥和骶髂、脊柱關(guān)節(jié)強直是強直性脊柱炎典型的病理變化[1]。該病患者的病理特征性改變是韌帶附著端病(enthesopathy),病

2、變原發(fā)部位是韌帶和關(guān)節(jié)囊等關(guān)節(jié)周圍軟組織[3]。本研究取強直性脊柱炎患者的韌帶,原代培養(yǎng)韌帶成纖維細胞,以腰椎滑脫韌帶成纖維細胞作為對照,用含地塞米松、抗壞血酸和β-磷酸甘油的誘導培養(yǎng)液誘導韌帶成纖維細胞向成骨細胞分化,發(fā)現(xiàn)到第14天成纖維細胞表達堿性磷酸酶,骨鈣素,并能形成大量礦化結(jié)節(jié),且AS患者的韌帶成纖維細胞骨鈣素的表達程度強于對照成纖維細胞。芯片檢測韌帶成纖維細胞向成骨細胞分化0天,7天,14天韌帶成纖維細胞microRNA和m

3、RNA表達譜的變化,數(shù)據(jù)分析發(fā)現(xiàn),和未誘導前相比,miR-29b在正常韌帶成纖維細胞成骨分化第7天上調(diào)1.73倍,在成骨分化第14天上調(diào)1.51倍,western blot實驗發(fā)現(xiàn)TGFβ3在成骨分化過程中表達下調(diào),與文獻報道[8]的其在間充質(zhì)細胞向成骨細胞分化過程中上調(diào)的結(jié)果一致,表明我們實驗方法的可行性,表明TGFβ通過Smad3來降低Runx2蛋白的表達和活性或者通過Smurf來介導Runx2降解,從而抑制成骨分化過程。本研究分為

4、四個部分：
　　 第一章：韌帶成纖維細胞的原代培養(yǎng)及誘導成骨分化。
　　 目的：原代培養(yǎng)強直性脊柱炎患者的韌帶成纖維細胞,并用含地塞米松、抗壞血酸和b-磷酸甘油的誘導培養(yǎng)液誘導其向成骨細胞分化。
　　 方法：取強直性脊柱炎患者的韌帶組織后,膠原酶消化法原代培養(yǎng)獲得韌帶成纖維細胞,取第三代細胞,用含地塞米松(10nM)、抗壞血酸(50μg/ml)和β-磷酸甘油(10mM)的誘導培養(yǎng)液誘導其向成骨細胞分化,堿性磷酸酶

5、顯色試劑盒觀察堿性磷酸酶的表達情況,RT-PCR檢測骨鈣素,RUNX2的表達情況,茜素紅染色觀察礦化結(jié)節(jié)的形成情況。
　　 結(jié)果：成功培養(yǎng)出強直性脊柱炎患者的韌帶成纖維細胞,經(jīng)地塞米松、抗壞血酸和b-磷酸甘油的誘導,堿性磷酸酶顯色試劑盒觀察到基質(zhì)成熟期堿性磷酸酶開始表達,RT-PCR檢測到骨鈣素,RUNX2的表達,茜素紅染色觀察到礦化結(jié)節(jié)的形成。
　　 結(jié)論：成功培養(yǎng)出韌帶成纖維細胞,并在誘導培養(yǎng)液的誘導下表達成骨細胞表

6、型。
　　 第二章：韌帶成纖維細胞成骨分化過程microRNA和mRNA表達譜的檢測。
　　 目的：尋找強直性脊柱炎患者的韌帶成纖維細胞在成骨分化過程中差異表達的microRNA和mRNA。
　　 方法：取誘導分化0天,7天,14天的韌帶成纖維細胞,分別提取microRNA和mRNA,分別用CIfRYTM LNA芯片和NimbleGen芯片檢測差異表達的microRNA和mRNA,生物信息學分析差異表達的micr

7、oRNA和mRNA。
　　 結(jié)果：與誘導前相比,強直性脊柱炎患者的韌帶成纖維細胞成骨分化過程第7天有130個microRNA和801個mRNA表達上調(diào),679個microRNA和1527個mRNA表達下調(diào);成骨分化第14天有306個microRNA和1153個mRNA表達上調(diào),490個microRNA和1125個mRNA表達下調(diào);和正常的韌帶成纖維細胞相比,有61個microRNA和2537個mRNA表達上調(diào),82個microR

8、NA和1166個mRNA表達下調(diào);其中,miR-1246在成骨分化第7天上調(diào)1.48倍,成骨分化第14天上調(diào)3.69倍;miR-31*在成骨分化第7天下調(diào)0.30倍,在成骨分化第14天下調(diào)0.06倍。
　　 結(jié)論：通過對韌帶成纖維細胞進行microRNA和mRNA表達譜分析,我們找出了大量差異表達的microRNA和mRNA,數(shù)據(jù)初步分析發(fā)現(xiàn)差異表達的基因除涉及BMPs、Wnt、Hedgehog及Notch等信號通路,還存在其他

9、差異表達顯著的microRNA和mRNA未見其與間充質(zhì)細胞成骨分化功能有關(guān)的報道,表明韌帶成纖維細胞的成骨分化過程可能還存在新的機制,這為我們進一步研究成骨分化機制奠定了基礎(chǔ)。
　　 第三章：韌帶成纖維細胞成骨分化過程蛋白表達譜的分析。
　　 目的：尋找強直性脊柱炎患者的韌帶成纖維細胞在成骨分化過程中差異表達的蛋白。
　　 方法：取誘導分化0天,7天,14天的強直性脊柱炎患者的韌帶成纖維細胞,提取總蛋白,雙向電泳

10、技術(shù)分離蛋白,質(zhì)譜分析差異表達的蛋白。
　　 結(jié)果：與誘導前相比,強直性脊柱炎患者的韌帶成纖維細胞成骨分化過程第7天有10個蛋白表達上調(diào),20個蛋白表達下調(diào),成骨分化第14天有7個蛋白表達上調(diào),23個蛋白表達下調(diào)。經(jīng)質(zhì)譜鑒定發(fā)現(xiàn)20個差別比較明顯的點,經(jīng)Mascot Search軟件分析,發(fā)現(xiàn)差異表達的蛋白有腫瘤壞死因子α誘導的蛋白、NF-kappa-B抑制劑相互作用Ras樣蛋白、AnnexinA2和淋巴細胞侵入和轉(zhuǎn)移誘導蛋白2

11、等。
　　 結(jié)論：通過對韌帶成纖維細胞進行蛋白表達譜分析,我們發(fā)現(xiàn)了腫瘤壞死因子α誘導的蛋白、NF-kappa-B抑制劑相互作用Ras樣蛋白和Splicing factor,proline-andglutamine-rich等蛋白表達下調(diào),T淋巴細胞侵入和轉(zhuǎn)移誘導蛋白2、Cysteinedesulfurase和Poly(A)polymerase gamma等蛋白表達上調(diào),為后續(xù)研究奠定了基礎(chǔ)。
　　 第四章：miR-31

12、*及miR-29b在成纖維細胞礦化中的變化及靶基因驗證。
　　 目的：生物信息學分析找出差異表達的microRNA、mRNA和蛋白,qRT-PCR和westernblot驗證差異表達的microRNA和蛋白。
　　 方法：利用Agilent Gene Spring GX11.0軟件對差異表達的microRNA、mENA進行生物信息學分析,microRNA和mRNA表達譜數(shù)據(jù)結(jié)合microRNA.org-targets a

13、ndexpression軟件(http://www.microma.org/)及TargetScanHuman5.1軟件(http://www.targetscan.org/)預測差異表達microRNA的靶基因,并分別用qRT-PCR和western blot驗證。
　　 結(jié)果：和誘導前相比,韌帶成纖維細胞成骨分化過程中miR-21、miR-125b、miR-432及miR-31*表達明顯下調(diào),miR-1246和miR-29b