參附注射液對(duì)大鼠急性壓力超負(fù)荷及乳鼠心肌細(xì)胞缺糖缺氧損傷的影響.pdf

1、目的：采用腹主動(dòng)脈結(jié)扎的方法制作急性壓力超負(fù)荷大鼠模型，研究參附注射液對(duì)其進(jìn)行治療后，以及參附注射液提前干預(yù)后大鼠急性壓力超負(fù)荷在不同時(shí)間點(diǎn)的血流動(dòng)力學(xué)及心肌組織病理學(xué)變化，觀察參附注射液對(duì)急性壓力超負(fù)荷大鼠心肌組織ANP表達(dá)水平，及對(duì)急性壓力超負(fù)荷大鼠心肌組織Na<'+>-K<'+>ATPase與Ca<'2+>-ATPase表達(dá)水平的影響，并對(duì)腹主動(dòng)脈結(jié)扎致壓力超負(fù)荷大鼠心肌細(xì)胞凋亡率及凋亡相關(guān)基因Bcl-2、Bax蛋白表達(dá)的影響進(jìn)行

2、研究，同時(shí)采用體外培養(yǎng)心肌細(xì)胞的方法，并造成缺糖缺氧損傷模型，探討參附注射液對(duì)急性壓力超負(fù)荷大鼠的干預(yù)及治療作用及缺糖缺氧損傷的心肌細(xì)胞的作用。 方法：參照相關(guān)文獻(xiàn)制作急性壓力超負(fù)荷大鼠模型。實(shí)驗(yàn)分為： (1)藥物治療組：雄性Wistar 大鼠50只，隨機(jī)取8只作為假手術(shù)(Sham)組，其余42只行腹主動(dòng)脈結(jié)扎術(shù)。其中10只大鼠于腹主動(dòng)脈結(jié)扎術(shù)中死亡，32只存活大鼠隨機(jī)分為模型組、參附組、西地蘭組、多巴酚丁胺組，每組8只

3、。假手術(shù)組僅分離腹主動(dòng)脈而不結(jié)扎。術(shù)后2小時(shí)，分離大鼠左側(cè)頸外靜脈，分別推注①參附組：參附注射液0.5ml (人參皂甙3.5mg/1ml)；②西地蘭組：西地蘭0.5ml(0.036mg/1ml)；③多巴酚丁胺組：多巴酚丁胺0.5ml(1.8mg/1ml)。 (2)藥物提前干預(yù)組：65只雄性 Wistar 大鼠隨機(jī)分為5組。假手術(shù)組，模型組、參附高劑量組、參附低劑量組及依那普利組，其中假手術(shù)組為5只大鼠，其余四組各15只大鼠。參附

4、高劑量組與低劑量組大鼠分別以8ml/kg及4ml /kg腹腔注射參附注射液，同時(shí)以生理鹽水10ml/ kg灌服；依那普利組大鼠灌服依那普利溶液10ml/ kg(0.5mg/ml)，同時(shí)腹腔注射生理鹽水(8ml/kg)，每日一次，連用7日后行腹主動(dòng)脈結(jié)扎術(shù)；假手術(shù)組同時(shí)進(jìn)行腹腔注射(8ml/kg)及灌服生理鹽水(10ml/kg)，7日后作腹部正中切口2cm后鈍性分離腹主動(dòng)脈但不結(jié)扎腹主動(dòng)脈。 血流動(dòng)力學(xué)參數(shù): (1)藥物治

5、療組：術(shù)后2小時(shí)，插入左室導(dǎo)管，八道生理記錄儀記錄壓力曲線，計(jì)算左室收縮功能參數(shù)：左室內(nèi)壓峰值(LVSP)、左室壓力上升最大速度(+dp/dt<,max>)及左室舒張功能參數(shù)：左室舒張末內(nèi)壓(LVEDP)、左室壓力下降最大速度(-dp/dt<,max>)。 間隔5分鐘后，分別按不同組別從靜脈推注參附注射液、西地蘭及多巴酚丁胺，間隔10分鐘后再次記錄參附組、西地蘭組、多巴酚丁胺組大鼠的血流動(dòng)力學(xué)參數(shù)。 (2)藥物干預(yù)組：腹

6、主動(dòng)脈結(jié)扎術(shù)后1/2小時(shí)、1小時(shí)及2小時(shí)，于模型組、參附高劑量組、參附低劑量組及依那普利組中分別取5只大鼠行血流動(dòng)力學(xué)檢測(cè)及其他指標(biāo)檢測(cè)，同時(shí)測(cè)定假手術(shù)組上述3個(gè)時(shí)段血流動(dòng)力學(xué)參數(shù)及其他指標(biāo)。 采用放射免疫(RIA)法檢測(cè)心肌組織ANP表達(dá)，分光光度法測(cè)定心肌組織中Na<'+>/K<'+>ATPase,Ca<'2+>-ATPase 含量。具體操作步驟按說(shuō)明書進(jìn)行采用脫氧核糖核苷酸末端轉(zhuǎn)移酶介導(dǎo)的缺口末端標(biāo)記法(TUNEL)檢測(cè)心

7、肌細(xì)胞凋亡，采用免疫組織化學(xué)染色檢測(cè)心肌細(xì)胞Bcl-2與Bax 蛋白。采用全自動(dòng)圖像分析儀于HPIAS-2000圖像分析系統(tǒng)分析棕黃色陽(yáng)性顆粒的平均吸光度(A)用2-3天Wistar乳鼠進(jìn)行心肌細(xì)胞的分離、純化、培養(yǎng)，實(shí)驗(yàn)時(shí)用缺糖 Hanks液代替正常培養(yǎng)基。培養(yǎng)瓶?jī)?nèi)立即充入氮?dú)?1升/分流量)30秒，造成缺糖缺氧心肌細(xì)胞損傷模型。對(duì)照組用正常培養(yǎng)基不含氮?dú)馊∨囵B(yǎng)心肌細(xì)胞，隨機(jī)分為：1組：正常對(duì)照組；2組：缺糖缺氧組；3組：缺糖缺氧+參

8、附液高劑量組(含人參皂甙1000μg/ml)；4組：缺糖缺氧+參附液中劑量組(含人參皂甙500μg/ml)；5組：缺糖缺氧+參附液低劑量組(含人參皂甙250μg/ml)；6組：缺糖缺氧+依那普利組(500μg/ml)，于倒置顯微鏡下觀察心肌細(xì)胞生長(zhǎng)情況和搏動(dòng)頻率，MTT比色法檢測(cè)細(xì)胞活力，流式細(xì)胞儀檢測(cè)心肌細(xì)胞DNA含量、細(xì)胞周期及凋亡率。 結(jié)論：本文認(rèn)為急性壓力超負(fù)荷導(dǎo)致心肌射血時(shí)阻力增加，心臟做功增加的同時(shí)出現(xiàn)結(jié)構(gòu)性的變化，

9、以適應(yīng)這種后負(fù)荷的改變，即心肌重塑，在此過(guò)程中心肌的耗氧耗能急劇增加。但機(jī)體儲(chǔ)備有限，因此心肌細(xì)胞供氧供能相對(duì)不足，結(jié)果引起機(jī)體神經(jīng)內(nèi)分泌的激活如ANP表達(dá)增多，細(xì)胞因子分泌增多，進(jìn)一步引起心肌細(xì)胞的重塑，最終形成心室擴(kuò)張，肥厚；另一方面壓力牽張可直接導(dǎo)致心肌細(xì)胞的結(jié)構(gòu)及功能改變，引起相關(guān)基因的表達(dá)異常，Na<'+>-K<'+>-ATP酶、Ca<'++>-ATP酶表達(dá)的異常，并引發(fā)心肌細(xì)胞離子流障礙，同時(shí)由于能量及氧代謝異?？梢鹦募〖?xì)

10、胞凋亡，心肌細(xì)胞數(shù)目減少，這些因素共同形成心臟舒縮功能障礙，心功能衰竭，臨床上出現(xiàn)心慌、氣喘、乏力、肢冷、水腫等癥狀，這些與中醫(yī)之心氣不足、心腎陽(yáng)虛證候極為相似，故推測(cè)作為心衰根本病因的心腎陽(yáng)虛之生物學(xué)基礎(chǔ)可能在于心肌能量與氧代謝障礙。因此參附注射液益氣溫陽(yáng)作用機(jī)制可能在于改善了急性壓力超負(fù)荷狀態(tài)下心肌異常的能量及氧代謝，減少了心肌ANP表達(dá)，有效提高心肌細(xì)胞的Na<'+>/K<'+>ATPase及Ca<'2+>ATPase的表達(dá)水平，