建立穩(wěn)定表達(dá)IL-12的小鼠Lewis肺癌細(xì)胞系及IL-12活性檢測.pdf

1、目的：白介素-12(interleukin一12，IL-12)是具有抗瘤活性的細(xì)胞因子，構(gòu)建能在真核細(xì)胞內(nèi)穩(wěn)定表達(dá)小鼠白介素-12(murrineinterleukin-12interleukin-12，miL-12)的質(zhì)粒，建立穩(wěn)定表達(dá)小鼠IL-12(miL-12)的小鼠Lewis肺癌(Lewislungcarcinoma，LLC)細(xì)胞系LLC／miL-12，為進(jìn)一步研究IL-12的免疫調(diào)節(jié)機(jī)制和抗瘤免疫反應(yīng)奠定基礎(chǔ)。 方法：

2、通過聚合酶鏈反應(yīng)(PCR)擴(kuò)增質(zhì)粒pORF-miL-12(Elasti，全長)，雙酶切后將目的片段miL-12連接到真核表達(dá)載體pcDNA3．1(+)質(zhì)粒上，mil一12受pcDNA3．1(+)中mCMV啟動子驅(qū)動，將miL-12全長轉(zhuǎn)錄至同一mRNA上，對重組質(zhì)粒進(jìn)行鑒定后用脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染小鼠Lewis肺癌細(xì)胞(LLC)測其表達(dá)。流式細(xì)胞儀(FCM)觀察細(xì)胞周期和凋亡，G418篩選獲得陽性克隆后大量培養(yǎng)并檢測miL-12活性。 結(jié)

3、果：PCR成功擴(kuò)增出miL-12片段，PCR鑒定、酶切鑒定及測序均證實(shí)pcDNA3．1(+)一miL-12質(zhì)粒構(gòu)建成功，RT-PCR及ELISA證實(shí)重組質(zhì)粒在mRNA及蛋白質(zhì)水平均高表達(dá)miL-12。miL-12使LLC細(xì)胞周期重新分布，并促進(jìn)其凋亡。LLC／miL-12細(xì)胞培養(yǎng)上清能明顯引起刀豆蛋白A(ConA)激活的小鼠脾細(xì)胞增殖。 結(jié)論：pcDNA3．1(+)一miL-12真核表達(dá)質(zhì)粒構(gòu)建成功并能在LLC細(xì)胞中穩(wěn)定表達(dá)，成