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文檔簡介
1、目的:構建能在真核細胞內(nèi)穩(wěn)定表達小鼠白介素-12(murine interleukin-12,mIL-12)的重組質粒,建立穩(wěn)定表達小鼠IL-12的小鼠Lewis肺癌(Lewis lung carcinoma,LLC)細胞系LLC/ mIL-12,評估m(xù)IL-12重組質粒及LLC/ mIL-12瘤苗治療小鼠Lewis肺癌移植瘤的療效及LLC/ mIL-12瘤苗對荷Lewis肺癌小鼠的放療增敏作用。分析碘-131(iodine,131I)
2、標記抗肺癌單克隆抗體1E2在荷Lewis肺癌小鼠體內(nèi)分布,評估瘤內(nèi)注射131I標記單克隆抗體1E2(131I-1E2)對小鼠Lewis肺癌的生長抑制作用及IL-12瘤苗對131I-1E2抗體靶向治療的增效作用。 方法:通過PCR(Polymerase chain reaction,聚合酶鏈反應)擴增質粒pORF-mIL-12,雙酶切后將目的片段mIL-12連接到真核表達載體pcDNA3.1(+)質粒上,mIL-12受pcDNA3
3、.1(+)中小鼠巨細胞病毒(Mouse cytomegalovirus,CMV)啟動子驅動,將mIL-12全長轉錄至同一mRNA上,對重組質粒進行鑒定后脂質體轉染小鼠LLC細胞測IL-12表達。FCM(Flow cytometry,流式細胞儀)觀察細胞周期和凋亡,G418篩選獲得陽性克隆后檢測LLC/mIL-12活性,大量培養(yǎng)獲得IL-12瘤苗。于C57 BL/6小鼠右后肢皮下接種LLC細胞2×106個/只,成瘤后將小鼠隨機分成4組(n
4、=10),第1、4、7d瘤內(nèi)注射重組質粒或瘤苗,第14d處死小鼠,觀察腫瘤生長曲線、脾細胞CTL(Cytotoxic T lymphocyte,細胞毒T淋巴細胞)和NK(Natural killer,自然殺傷細胞)活性以及腫瘤浸潤淋巴細胞。進行放療增敏作用研究時,小鼠成瘤后隨機分組,在第0、7、14d瘤苗組和聯(lián)合組瘤內(nèi)注射瘤苗,第1、3、5d放療組和聯(lián)合組給予2Gy局部照射,對照組不作任何治療。第21d處死小鼠觀察腫瘤體積、重量、脾細胞
5、CTL和NK活性以及腫瘤細胞凋亡。取未治療荷Lewis肺癌小鼠腫瘤組織,免疫組化檢測LLC細胞膜上抗肺癌單克隆抗體1E2對應抗原-CPS-1(Carbamyl phosphate synthetase,氨甲酰磷酸合成酶)的表達。131I標記抗肺癌單克隆抗體1E2,檢測標記率、放化純度、放射性比活度。荷瘤小鼠尾靜脈注射標記抗體131I-1E218.5 MBq,觀察其不同時間點在小鼠體內(nèi)的分布。成瘤后小鼠隨機分成4組,第0,7,14d分別瘤
6、內(nèi)注射生理鹽水0.1ml(空白對照),1E2單抗3μg(陽性對照),131I-IgG18.5 MBq(陰性對照),131I-1E218.5 MBq(實驗組)。治療后每周2次測定腫瘤大小,21d后處死小鼠觀察腫瘤組織病理學改變,檢測腫瘤體積、重量,計算抑瘤率。為了觀察IL-12瘤苗對131I-1E2抗體靶向治療的增效作用,將mIL-12質粒轉染LLC細胞,Na131I標記1E2抗體,C57BL/6小鼠右后肢皮下建立荷瘤鼠模型,成瘤后隨機分
7、成四組,分別予PBS、GT(Gene therapy,即IL-12瘤苗)、RIT(Radioimmunotherapy,放射免疫治療)和GT+RIT(IL-12瘤苗+放射免疫治療)進行治療,測量腫瘤體積及重量,計算抑瘤率,檢測CTL和NK活性。荷瘤小鼠尾靜脈注射131I-1E218.5 MBq及瘤內(nèi)注射IL-12瘤苗與單純尾靜脈注射標記抗體比較,分析標記抗體在小鼠體內(nèi)的分布。 結果:PCR成功擴增出mIL-12片段,PCR鑒定、
8、酶切鑒定及測序均證實pcDNA3.1(+)-mIL-12質粒構建成功,RT-PCR及ELISA證實重組質粒在mRNA及蛋白質水平均高表達mIL-12。mIL-12使LLC細胞周期重新分布,并促進其凋亡。LLC/ mIL-12細胞培養(yǎng)上清能誘導ConA(Concanavalin A,刀豆蛋白A)激活的小鼠脾細胞增殖。LLC/mIL-12和pcDNA3.1(+)-mIL-12治療組腫瘤體積顯著縮小,mIL-12能增強NK和CTL活性,兩者均
9、以LLC/ mIL-12治療組作用更顯著,且LLC/ mIL-12和pcDNA3.1(+)-mIL-12治療組有大量CD4+、CD8+淋巴細胞浸潤。放療聯(lián)合IL-12瘤苗組腫瘤體積顯著縮小,NK和CTL活性增強,凋亡增加,與瘤苗組、對照組和放療組相比,p<0.05;放療組NK和CTL活性降低。1E2對應抗原CPS-1主要在腫瘤細胞膜表達,131I-1E2標記率為67.73%,放化純度為95.63%。131I-1E2主要分布在腫瘤組織,治
10、療后3w試驗組腫瘤體積為0.946±0.153 cm3,重量為1.802±0.194g,抑瘤率72.0%,與對照組間比較差異有統(tǒng)計學意義p<0.01),對照組之間差異無統(tǒng)計學意義(p>0.05)。治療組與對照組間病理學差異顯著。IL-12瘤苗能使131I-1E2更多積聚在腫瘤組織而減少正常組織損傷,從而使放射免疫治療劑量得以提高,而131I-1E2能增強IL-12基因治療效果。 結論:pcDNA3.1(+)-mIL-12真核表達
11、質粒構建成功并能在LLC細胞中穩(wěn)定表達,成功建立具有mIL-12生物學活性的LLC細胞系,LLC/mIL-12及pcDNA3.1(+)-mIL-12均能產(chǎn)生抗瘤免疫反應,且前者作用更強。LLC/ mIL-12瘤苗及放療均能產(chǎn)生抗瘤反應,且二者聯(lián)合作用更強。瘤苗放療增敏作用機制是誘導細胞凋亡,增強NK和CTL活性。131I-1E2瘤內(nèi)注射可抑制腫瘤的生長,具有潛在的臨床應用價值,有可能成為新的腫瘤靶向治療藥物。IL-12瘤苗能增強131I
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