IL-12真核表達質粒構建及其瘤苗抗肺癌免疫作用研究.pdf

1、目的：構建能在真核細胞內(nèi)穩(wěn)定表達小鼠白介素-12（murine interleukin-12，mIL-12）的重組質粒，建立穩(wěn)定表達小鼠IL-12的小鼠Lewis肺癌（Lewis lung carcinoma，LLC）細胞系LLC/ mIL-12，評估m(xù)IL-12重組質粒及LLC/ mIL-12瘤苗治療小鼠Lewis肺癌移植瘤的療效及LLC/ mIL-12瘤苗對荷Lewis肺癌小鼠的放療增敏作用。分析碘-131（iodine，131I）

2、標記抗肺癌單克隆抗體1E2在荷Lewis肺癌小鼠體內(nèi)分布，評估瘤內(nèi)注射131I標記單克隆抗體1E2（131I-1E2）對小鼠Lewis肺癌的生長抑制作用及IL-12瘤苗對131I-1E2抗體靶向治療的增效作用。 方法：通過PCR（Polymerase chain reaction，聚合酶鏈反應）擴增質粒pORF-mIL-12，雙酶切后將目的片段mIL-12連接到真核表達載體pcDNA3.1（+）質粒上，mIL-12受pcDNA3

3、.1（+）中小鼠巨細胞病毒（Mouse cytomegalovirus，CMV）啟動子驅動，將mIL-12全長轉錄至同一mRNA上，對重組質粒進行鑒定后脂質體轉染小鼠LLC細胞測IL-12表達。FCM（Flow cytometry，流式細胞儀）觀察細胞周期和凋亡，G418篩選獲得陽性克隆后檢測LLC/mIL-12活性，大量培養(yǎng)獲得IL-12瘤苗。于C57 BL/6小鼠右后肢皮下接種LLC細胞2×106個/只，成瘤后將小鼠隨機分成4組（n

4、=10），第1、4、7d瘤內(nèi)注射重組質粒或瘤苗，第14d處死小鼠，觀察腫瘤生長曲線、脾細胞CTL（Cytotoxic T lymphocyte，細胞毒T淋巴細胞）和NK（Natural killer，自然殺傷細胞）活性以及腫瘤浸潤淋巴細胞。進行放療增敏作用研究時，小鼠成瘤后隨機分組，在第0、7、14d瘤苗組和聯(lián)合組瘤內(nèi)注射瘤苗，第1、3、5d放療組和聯(lián)合組給予2Gy局部照射，對照組不作任何治療。第21d處死小鼠觀察腫瘤體積、重量、脾細胞

5、CTL和NK活性以及腫瘤細胞凋亡。取未治療荷Lewis肺癌小鼠腫瘤組織，免疫組化檢測LLC細胞膜上抗肺癌單克隆抗體1E2對應抗原-CPS-1（Carbamyl phosphate synthetase，氨甲酰磷酸合成酶）的表達。131I標記抗肺癌單克隆抗體1E2，檢測標記率、放化純度、放射性比活度。荷瘤小鼠尾靜脈注射標記抗體131I-1E218.5 MBq，觀察其不同時間點在小鼠體內(nèi)的分布。成瘤后小鼠隨機分成4組，第0，7，14d分別瘤

6、內(nèi)注射生理鹽水0.1ml（空白對照），1E2單抗3μg（陽性對照），131I-IgG18.5 MBq（陰性對照），131I-1E218.5 MBq（實驗組）。治療后每周2次測定腫瘤大小，21d后處死小鼠觀察腫瘤組織病理學改變，檢測腫瘤體積、重量，計算抑瘤率。為了觀察IL-12瘤苗對131I-1E2抗體靶向治療的增效作用，將mIL-12質粒轉染LLC細胞，Na131I標記1E2抗體，C57BL/6小鼠右后肢皮下建立荷瘤鼠模型，成瘤后隨機分

7、成四組，分別予PBS、GT（Gene therapy，即IL-12瘤苗）、RIT（Radioimmunotherapy，放射免疫治療）和GT+RIT（IL-12瘤苗+放射免疫治療）進行治療，測量腫瘤體積及重量，計算抑瘤率，檢測CTL和NK活性。荷瘤小鼠尾靜脈注射131I-1E218.5 MBq及瘤內(nèi)注射IL-12瘤苗與單純尾靜脈注射標記抗體比較，分析標記抗體在小鼠體內(nèi)的分布。 結果：PCR成功擴增出mIL-12片段，PCR鑒定、

8、酶切鑒定及測序均證實pcDNA3.1（+）-mIL-12質粒構建成功，RT-PCR及ELISA證實重組質粒在mRNA及蛋白質水平均高表達mIL-12。mIL-12使LLC細胞周期重新分布，并促進其凋亡。LLC/ mIL-12細胞培養(yǎng)上清能誘導ConA（Concanavalin A，刀豆蛋白A）激活的小鼠脾細胞增殖。LLC/mIL-12和pcDNA3.1（+）-mIL-12治療組腫瘤體積顯著縮小，mIL-12能增強NK和CTL活性，兩者均

9、以LLC/ mIL-12治療組作用更顯著，且LLC/ mIL-12和pcDNA3.1（+）-mIL-12治療組有大量CD4+、CD8+淋巴細胞浸潤。放療聯(lián)合IL-12瘤苗組腫瘤體積顯著縮小，NK和CTL活性增強，凋亡增加，與瘤苗組、對照組和放療組相比，p<0.05；放療組NK和CTL活性降低。1E2對應抗原CPS-1主要在腫瘤細胞膜表達，131I-1E2標記率為67.73％，放化純度為95.63％。131I-1E2主要分布在腫瘤組織，治

10、療后3w試驗組腫瘤體積為0.946±0.153 cm3，重量為1.802±0.194g，抑瘤率72.0％，與對照組間比較差異有統(tǒng)計學意義p<0.01），對照組之間差異無統(tǒng)計學意義（p>0.05）。治療組與對照組間病理學差異顯著。IL-12瘤苗能使131I-1E2更多積聚在腫瘤組織而減少正常組織損傷，從而使放射免疫治療劑量得以提高，而131I-1E2能增強IL-12基因治療效果。 結論：pcDNA3.1（+）-mIL-12真核表達

11、質粒構建成功并能在LLC細胞中穩(wěn)定表達，成功建立具有mIL-12生物學活性的LLC細胞系，LLC/mIL-12及pcDNA3.1（+）-mIL-12均能產(chǎn)生抗瘤免疫反應，且前者作用更強。LLC/ mIL-12瘤苗及放療均能產(chǎn)生抗瘤反應，且二者聯(lián)合作用更強。瘤苗放療增敏作用機制是誘導細胞凋亡，增強NK和CTL活性。131I-1E2瘤內(nèi)注射可抑制腫瘤的生長，具有潛在的臨床應用價值，有可能成為新的腫瘤靶向治療藥物。IL-12瘤苗能增強131I