IL-12真核表達(dá)質(zhì)粒構(gòu)建及其瘤苗抗肺癌免疫作用研究.pdf

1、目的：構(gòu)建能在真核細(xì)胞內(nèi)穩(wěn)定表達(dá)小鼠白介素-12（murine interleukin-12，mIL-12）的重組質(zhì)粒，建立穩(wěn)定表達(dá)小鼠IL-12的小鼠Lewis肺癌（Lewis lung carcinoma，LLC）細(xì)胞系LLC/ mIL-12，評(píng)估m(xù)IL-12重組質(zhì)粒及LLC/ mIL-12瘤苗治療小鼠Lewis肺癌移植瘤的療效及LLC/ mIL-12瘤苗對(duì)荷Lewis肺癌小鼠的放療增敏作用。分析碘-131（iodine，131I）

2、標(biāo)記抗肺癌單克隆抗體1E2在荷Lewis肺癌小鼠體內(nèi)分布，評(píng)估瘤內(nèi)注射131I標(biāo)記單克隆抗體1E2（131I-1E2）對(duì)小鼠Lewis肺癌的生長(zhǎng)抑制作用及IL-12瘤苗對(duì)131I-1E2抗體靶向治療的增效作用。 方法：通過PCR（Polymerase chain reaction，聚合酶鏈反應(yīng)）擴(kuò)增質(zhì)粒pORF-mIL-12，雙酶切后將目的片段mIL-12連接到真核表達(dá)載體pcDNA3.1（+）質(zhì)粒上，mIL-12受pcDNA3

3、.1（+）中小鼠巨細(xì)胞病毒（Mouse cytomegalovirus，CMV）啟動(dòng)子驅(qū)動(dòng)，將mIL-12全長(zhǎng)轉(zhuǎn)錄至同一mRNA上，對(duì)重組質(zhì)粒進(jìn)行鑒定后脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染小鼠LLC細(xì)胞測(cè)IL-12表達(dá)。FCM（Flow cytometry，流式細(xì)胞儀）觀察細(xì)胞周期和凋亡，G418篩選獲得陽性克隆后檢測(cè)LLC/mIL-12活性，大量培養(yǎng)獲得IL-12瘤苗。于C57 BL/6小鼠右后肢皮下接種LLC細(xì)胞2×106個(gè)/只，成瘤后將小鼠隨機(jī)分成4組（n

4、=10），第1、4、7d瘤內(nèi)注射重組質(zhì)粒或瘤苗，第14d處死小鼠，觀察腫瘤生長(zhǎng)曲線、脾細(xì)胞CTL（Cytotoxic T lymphocyte，細(xì)胞毒T淋巴細(xì)胞）和NK（Natural killer，自然殺傷細(xì)胞）活性以及腫瘤浸潤(rùn)淋巴細(xì)胞。進(jìn)行放療增敏作用研究時(shí)，小鼠成瘤后隨機(jī)分組，在第0、7、14d瘤苗組和聯(lián)合組瘤內(nèi)注射瘤苗，第1、3、5d放療組和聯(lián)合組給予2Gy局部照射，對(duì)照組不作任何治療。第21d處死小鼠觀察腫瘤體積、重量、脾細(xì)胞

5、CTL和NK活性以及腫瘤細(xì)胞凋亡。取未治療荷Lewis肺癌小鼠腫瘤組織，免疫組化檢測(cè)LLC細(xì)胞膜上抗肺癌單克隆抗體1E2對(duì)應(yīng)抗原-CPS-1（Carbamyl phosphate synthetase，氨甲酰磷酸合成酶）的表達(dá)。131I標(biāo)記抗肺癌單克隆抗體1E2，檢測(cè)標(biāo)記率、放化純度、放射性比活度。荷瘤小鼠尾靜脈注射標(biāo)記抗體131I-1E218.5 MBq，觀察其不同時(shí)間點(diǎn)在小鼠體內(nèi)的分布。成瘤后小鼠隨機(jī)分成4組，第0，7，14d分別瘤

6、內(nèi)注射生理鹽水0.1ml（空白對(duì)照），1E2單抗3μg（陽性對(duì)照），131I-IgG18.5 MBq（陰性對(duì)照），131I-1E218.5 MBq（實(shí)驗(yàn)組）。治療后每周2次測(cè)定腫瘤大小，21d后處死小鼠觀察腫瘤組織病理學(xué)改變，檢測(cè)腫瘤體積、重量，計(jì)算抑瘤率。為了觀察IL-12瘤苗對(duì)131I-1E2抗體靶向治療的增效作用，將mIL-12質(zhì)粒轉(zhuǎn)染LLC細(xì)胞，Na131I標(biāo)記1E2抗體，C57BL/6小鼠右后肢皮下建立荷瘤鼠模型，成瘤后隨機(jī)分

7、成四組，分別予PBS、GT（Gene therapy，即IL-12瘤苗）、RIT（Radioimmunotherapy，放射免疫治療）和GT+RIT（IL-12瘤苗+放射免疫治療）進(jìn)行治療，測(cè)量腫瘤體積及重量，計(jì)算抑瘤率，檢測(cè)CTL和NK活性。荷瘤小鼠尾靜脈注射131I-1E218.5 MBq及瘤內(nèi)注射IL-12瘤苗與單純尾靜脈注射標(biāo)記抗體比較，分析標(biāo)記抗體在小鼠體內(nèi)的分布。 結(jié)果：PCR成功擴(kuò)增出mIL-12片段，PCR鑒定、

8、酶切鑒定及測(cè)序均證實(shí)pcDNA3.1（+）-mIL-12質(zhì)粒構(gòu)建成功，RT-PCR及ELISA證實(shí)重組質(zhì)粒在mRNA及蛋白質(zhì)水平均高表達(dá)mIL-12。mIL-12使LLC細(xì)胞周期重新分布，并促進(jìn)其凋亡。LLC/ mIL-12細(xì)胞培養(yǎng)上清能誘導(dǎo)ConA（Concanavalin A，刀豆蛋白A）激活的小鼠脾細(xì)胞增殖。LLC/mIL-12和pcDNA3.1（+）-mIL-12治療組腫瘤體積顯著縮小，mIL-12能增強(qiáng)NK和CTL活性，兩者均

9、以LLC/ mIL-12治療組作用更顯著，且LLC/ mIL-12和pcDNA3.1（+）-mIL-12治療組有大量CD4+、CD8+淋巴細(xì)胞浸潤(rùn)。放療聯(lián)合IL-12瘤苗組腫瘤體積顯著縮小，NK和CTL活性增強(qiáng)，凋亡增加，與瘤苗組、對(duì)照組和放療組相比，p<0.05；放療組NK和CTL活性降低。1E2對(duì)應(yīng)抗原CPS-1主要在腫瘤細(xì)胞膜表達(dá)，131I-1E2標(biāo)記率為67.73％，放化純度為95.63％。131I-1E2主要分布在腫瘤組織，治

10、療后3w試驗(yàn)組腫瘤體積為0.946±0.153 cm3，重量為1.802±0.194g，抑瘤率72.0％，與對(duì)照組間比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義p<0.01），對(duì)照組之間差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（p>0.05）。治療組與對(duì)照組間病理學(xué)差異顯著。IL-12瘤苗能使131I-1E2更多積聚在腫瘤組織而減少正常組織損傷，從而使放射免疫治療劑量得以提高，而131I-1E2能增強(qiáng)IL-12基因治療效果。 結(jié)論：pcDNA3.1（+）-mIL-12真核表達(dá)

11、質(zhì)粒構(gòu)建成功并能在LLC細(xì)胞中穩(wěn)定表達(dá)，成功建立具有mIL-12生物學(xué)活性的LLC細(xì)胞系，LLC/mIL-12及pcDNA3.1（+）-mIL-12均能產(chǎn)生抗瘤免疫反應(yīng)，且前者作用更強(qiáng)。LLC/ mIL-12瘤苗及放療均能產(chǎn)生抗瘤反應(yīng)，且二者聯(lián)合作用更強(qiáng)。瘤苗放療增敏作用機(jī)制是誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡，增強(qiáng)NK和CTL活性。131I-1E2瘤內(nèi)注射可抑制腫瘤的生長(zhǎng)，具有潛在的臨床應(yīng)用價(jià)值，有可能成為新的腫瘤靶向治療藥物。IL-12瘤苗能增強(qiáng)131I