元通合劑體外抗HSV-2作用的實(shí)驗(yàn)研究.pdf

1、目的：探討元通合劑對(duì)2型皰疹病毒(HSV-2)的抑制作用，采用Vero細(xì)胞培養(yǎng)技術(shù)對(duì)元通合劑(YT)水提物體外抗HSV-2的藥效實(shí)驗(yàn)進(jìn)行研究。 方法：1.元通合劑的細(xì)胞毒性測(cè)定將6個(gè)不同濃度(5倍遞次稀釋)的元通合劑及陽性對(duì)照藥物ACV分別加入已長(zhǎng)成單層的Vero細(xì)胞培養(yǎng)板中，每濃度4復(fù)孔，同時(shí)設(shè)不加藥物的正常Vero細(xì)胞對(duì)照組，置于37℃、5％CO2孵箱內(nèi)培養(yǎng)。逐日倒置顯微鏡下觀察記錄元通合劑對(duì)Vero細(xì)胞的病變效應(yīng)(CPE)

2、，連續(xù)觀察4d。以不出現(xiàn)細(xì)胞變暗、變圓、融合形成空斑、脫落等病變的藥物最小稀釋倍數(shù)為最大無毒濃度(TC0)，并按Reed-Muench法分別算出待檢藥物及陽性對(duì)照藥物ACV的半數(shù)中毒濃度(TC50)。 2.病毒毒力測(cè)定將病毒培養(yǎng)懸液用PBS按10倍遞次稀釋成10-1～10-7的不同稀釋度。向預(yù)先培養(yǎng)成層的Vero細(xì)胞加入不同濃度的HSV-Ⅱ液。每濃度4復(fù)孔，同時(shí)設(shè)不加病毒的正常Vero細(xì)胞對(duì)照組，置于37℃、5％CO2孵箱內(nèi)培養(yǎng)

3、。逐日觀察CPE。記錄病變程度和孔數(shù)，待細(xì)胞病變不再繼續(xù)判定結(jié)果。CPE達(dá)50％(++)以上則計(jì)為病變孔，(++)以下則計(jì)為非病變孔。根據(jù)Reed-Muench法計(jì)算TCID50。 3.抗病毒藥效測(cè)定用PBS將病毒稀釋成100TCID50備用。分別設(shè)不同濃度(選用TC0藥液，用維持液倍比稀釋8個(gè)濃度)的元通合劑組(yuantonggroup，YTG)、阿昔洛韋組(Acyclovirgroup，ACVG)、不加藥物的病毒對(duì)照(vi

4、ruscontrolgroup，VCG)和正常細(xì)胞對(duì)照組(normalcellcontrolgroup，NCG)，各組均設(shè)3復(fù)孔。以下列加藥方式進(jìn)行實(shí)驗(yàn)：Ⅰ.增殖抑制法-細(xì)胞以病毒液吸附1.5h后，棄去病毒液加入藥物；Ⅱ.感染阻斷法-細(xì)胞加藥物培養(yǎng)24h，棄去含藥物的維持液，加入病毒攻擊；Ⅲ.直接殺滅法-藥物與病毒共同孵育24h后再感染細(xì)胞。此后各組細(xì)胞繼續(xù)置37℃、5％CO2孵箱內(nèi)培養(yǎng)72h。逐日倒置顯微鏡下觀察記錄CPE結(jié)果。培養(yǎng)7

5、2小時(shí)后，MTT比色法測(cè)定A490值。計(jì)算累積細(xì)胞存活率(cellsurvivrate，CSR％)、藥物的病毒抑制率(inhibitoryrate，IR％)并按照Reed-Muench法分別計(jì)算兩種藥物對(duì)病毒的半數(shù)抑制濃度(IC50)和選擇指數(shù)(SI)。結(jié)果：1本實(shí)驗(yàn)測(cè)得，元通合劑及ACV對(duì)Vero細(xì)胞的TC0分別為0.16、0.1mg/ml。二者對(duì)Vero細(xì)胞的TC50分別為6.218、0.468mg/ml。 2將病毒原液行連

6、續(xù)10倍遞次稀釋，進(jìn)行病毒感染性測(cè)定，測(cè)得HSV-2333病毒株的TCID50=10-4/0.1ml。 3三種不同藥物加入方式下，實(shí)驗(yàn)所設(shè)病毒對(duì)照組均可見典型CPE，正常細(xì)胞對(duì)照組均無明顯病變。方式IYT和ACV均能不同程度抑制HSV-2所致CPE；方式Ⅱ和ⅢYT能不同程度抑制HSV-2所致CPE，而ACV組可見明顯CPE。 4用MTT比色法測(cè)定正常細(xì)胞對(duì)照組及病毒對(duì)照組平均A490值分別為0.278+0.035、0.0

7、37+0.0054。方式Ⅰ加藥，幾乎各濃度YT和ACV的平均A490值與病毒對(duì)照組比較，均有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P＜0.05或P＜0.01)；方式Ⅱ加藥，部分濃度YT的平均A490值與病毒對(duì)照組比較，有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P＜0.05)；方式Ⅲ加藥，幾乎各濃度YT的平均A490值與病毒對(duì)照組比較，均有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P＜0.05或P＜0.01)；方式Ⅱ和Ⅲ加藥，ACV的平均A490值與病毒對(duì)照組比較，均無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P＞0.05)。 5三種藥物加入

8、方式下，方式ⅠYT的IC50、SI分別為17.3μg/ml、359.4；ACV的相應(yīng)數(shù)值分別為10.4μg/ml、45.0；方式ⅡYT的IC50、SI分別為94.1μg/ml、66.1；方式ⅢYT的IC50、SI分別為17.1μg/ml、363.6；方式Ⅱ和Ⅲ各濃度ACV的IR％均未超過5％。 6以藥物濃度為橫坐標(biāo)(μg/ml)、病毒抑制率(IR％)為縱坐標(biāo)繪出不同藥物加入方式下的劑量-效應(yīng)關(guān)系圖。方式ⅠACV對(duì)HSV-2的抑制

9、作用隨濃度升高而增強(qiáng)，存在明顯的量效關(guān)系；而YT濃度達(dá)到40μg/ml時(shí)，其對(duì)HSV-2的抑制作用隨濃度升高反而降低；方式ⅡYT濃度超過20μg/ml，其對(duì)HSV-2的抑制作用隨濃度升高而增強(qiáng)；方式ⅢYT濃度達(dá)到80μg/ml時(shí)也出現(xiàn)IR％隨濃度升高而降低。 結(jié)論：1濃度低于0.16mg/ml的YT對(duì)Vero細(xì)胞無毒，其TC50是ACV的13.3倍。三種給藥方式Y(jié)T的SI分別為ACV的8.0、1.5、8.1倍，YT對(duì)Vero細(xì)胞

10、非常安全。 2YT和ACV均能不同程度地抑制Vero細(xì)胞內(nèi)HSV-2的增殖，比較IC50，ACV對(duì)HSV-2增殖抑制的活性為YT的1.67倍；YT對(duì)HSV-2有直接殺滅作用，且對(duì)HSV-2的感染有一定的預(yù)防作用，而ACV無直接殺滅及預(yù)防作用。YT體外從多個(gè)作用環(huán)節(jié)較強(qiáng)地抑制HSV-2。 3ACV對(duì)HSV-2增殖抑制有明顯的劑量-效應(yīng)關(guān)系；YT對(duì)HSV-2感染阻斷作用存在量效關(guān)系；但其對(duì)HSV-2增殖抑制及直接殺滅作用無明