HSV-2感染ECV304細(xì)胞的生物學(xué)效應(yīng)研究.pdf

1、動脈粥樣硬化(AS)嚴(yán)重威脅人類健康，雖然大量的流行病學(xué)資料顯示傳統(tǒng)的危險因子是動脈粥樣硬化的主要危險因素，但動脈粥樣硬化仍然有許多潛在的病因亟待探索。研究表明，病原微生物感染可能參與了動脈粥樣硬化的發(fā)生發(fā)展，感染后的炎癥反應(yīng)在動脈粥樣硬化的發(fā)生過程中發(fā)揮重要作用。有關(guān)病毒感染與AS的關(guān)系逐漸受到人們重視，血清流行病學(xué)和分子生物學(xué)的研究資料表明，HSV及其DNA序列存在于AS的病灶組織，主要見于血管平滑肌細(xì)胞(SMC)和內(nèi)皮細(xì)胞(EC)

2、，且AS患者血清HSV的抗體陽性率明顯增高，提示HSV的感染在AS的形成和發(fā)生發(fā)展過程中可能起重要作用。迄今為止，對于HSV如何參與AS的發(fā)病機(jī)制尚缺乏深入的了解，病毒對體外靶細(xì)胞的作用可以反映病毒對體內(nèi)細(xì)胞的直接作用，研究體外情況下HSV感染血管內(nèi)皮細(xì)胞的生物學(xué)效應(yīng)，對闡明HSV的致病機(jī)制具有非常重要的意義。目前研究發(fā)現(xiàn)，HSV可通過內(nèi)皮毒性作用、損害內(nèi)皮依賴的舒張功能及影響內(nèi)皮粘附功能等方式造成內(nèi)皮結(jié)構(gòu)和功能損傷，但其潛在的基因水平

3、的機(jī)制尚不清楚。傳統(tǒng)的RNA方法學(xué)如Northern斑點雜交分析一次只能研究一種基因，成本高，效率低，而新興的基因芯片技術(shù)，提供了一種基因差異表達(dá)的高通量研究工具。本實驗應(yīng)用基因芯片技術(shù)研究了HSV-2對人臍靜脈內(nèi)皮樣細(xì)胞(ECV-304)基因表達(dá)的影響，以探討HSV導(dǎo)致血管內(nèi)皮損傷和動脈粥樣硬化的基因機(jī)制。 基于以上設(shè)想，擬主要觀測：①感染細(xì)胞形態(tài)變化；②病毒核酸代謝、病毒抗原表達(dá)；③感染細(xì)胞基因表達(dá)方面的變化。探討以上內(nèi)容的

4、變化特點和規(guī)律，在細(xì)胞和分子水平上闡述HSV致血管內(nèi)皮細(xì)胞的生物學(xué)效應(yīng)，為進(jìn)一步揭示HSV的致病機(jī)制及其治療和預(yù)防提供一定的理論基礎(chǔ)。 方法： 1.采用HSV-2感染體外培養(yǎng)的ECV-304細(xì)胞，建立HSV的細(xì)胞感染模型。 2.對于ECV-304細(xì)胞的感染模型，主要運用相差顯微鏡和電子顯微鏡觀察感染細(xì)胞的形態(tài)變化，熒光顯微鏡觀測病毒抗原的表達(dá)，噻唑藍(lán)(MTT)比色法檢測細(xì)胞增殖的變化，流式細(xì)胞儀測定HSV感染后的

5、細(xì)胞凋亡狀況。 3.在細(xì)胞感染早期，應(yīng)用人全基因組寡核苷酸表達(dá)譜芯片篩選差異表達(dá)的基因，并利用生物學(xué)信息的手段分析這些差異基因所參與的生物過程。 4.選擇2個上調(diào)基因(SP100基因和RPS24基因)和2個下調(diào)基因(RTP801基因和HNRPA1基因)應(yīng)用實時定量PCR加以驗證，比較實時定量PCR和基因表達(dá)譜芯片二種檢測方法所得結(jié)果的相關(guān)性。 5.各項指標(biāo)以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示，兩組均值間比較用單向方差分析(One-

6、wayANOVA)檢驗，統(tǒng)計學(xué)處理均在計算機(jī)上用SPSS10.0軟件完成。P＜0.05表示有顯著性差異。 主要結(jié)果： 1.病毒抗原表達(dá)變化：HSV-2感染ECV-304細(xì)胞后，細(xì)胞胞漿內(nèi)出現(xiàn)片狀或顆粒性黃綠色熒光，說明ECV-304細(xì)胞內(nèi)存在HSV-2病毒抗原表達(dá)。 2.細(xì)胞增殖變化：HSV-2感染ECV-304細(xì)胞后12h和24h，細(xì)胞的抑制率分別為18.6％和47.2％，統(tǒng)計學(xué)分析表明，病毒在不同時相對同一株

7、細(xì)胞的抑制率均存在顯著性差異。 3.感染細(xì)胞形態(tài)變化：HSV-2感染ECV-304細(xì)胞后12h，出現(xiàn)灶性細(xì)胞病變，主要為細(xì)胞逐漸變圓、變大，核變大、核膜移位，折光性差。接種后24h病變范圍呈片狀擴(kuò)大，融合成多核巨細(xì)胞，染色體著邊、核破碎。48h大部分細(xì)胞脫落、多核巨細(xì)胞裂解。電鏡結(jié)果顯示，感染后12h，ECV304細(xì)胞出現(xiàn)細(xì)胞融合，典型的核染色質(zhì)濃集，分布與核膜周邊，形成花瓣形核，內(nèi)質(zhì)網(wǎng)增多，繞核周分布，且出現(xiàn)大而明顯的空泡，空

8、泡內(nèi)有少量未成熟的病毒粒子。感染后24h，ECV304細(xì)胞出現(xiàn)多核巨細(xì)胞，線粒體內(nèi)嵴紊亂、斷裂，出現(xiàn)不同程度的自噬化、溶酶體化、空泡化，并可見到大量“鷹眼樣”的已包裝成熟的病毒顆粒以及正在包裝的病毒粒子。 4.細(xì)胞凋亡檢測：經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳分析，HSV-2感染ECV-304細(xì)胞后對照組及感染組均未見典型的細(xì)胞DNA降解梯狀條帶。經(jīng)流式細(xì)胞儀檢測，對照組及感染組均未出現(xiàn)G1峰左側(cè)的亞二倍體細(xì)胞群峰型(亞G1峰，也稱凋亡峰)，提示H

9、SV-2感染ECV304細(xì)胞后未發(fā)生凋亡現(xiàn)象。 5.基因芯片檢測：通過對HSV-2感染ECV-304細(xì)胞后6h的對照組及感染組基因表達(dá)譜芯片檢測發(fā)現(xiàn)，每張芯片共有18775個數(shù)據(jù)為有效數(shù)據(jù)，其中共有462個基因存在顯著性表達(dá)差異，與對照組相比在實驗組中有318個基因發(fā)生了上調(diào)表達(dá)變化，144個基因發(fā)生了下調(diào)表達(dá)變化。主要包括與細(xì)胞粘附、信號傳遞、細(xì)胞分裂、DNA復(fù)制、細(xì)胞周期、炎性反應(yīng)、凋亡、離子通道、細(xì)胞受體、免疫和代謝等相關(guān)

10、的基因。 6.通過生物信息學(xué)分析差異基因所參與的生物過程，結(jié)果發(fā)現(xiàn)462條差異基因共參與了237個生物過程，其中有79個生物過程具有顯著性差異(P＜0.05)。主要包括蛋白質(zhì)合成、信號傳遞、蛋白質(zhì)折疊、RNA剪接、離子通道、核糖體的合成和組裝、細(xì)胞呼吸、DNA和mRNA代謝等生物過程。與蛋白質(zhì)合成相關(guān)的RPS10、RPS20、EEF1B2、SUI1等73個基因普遍上調(diào)，WBSCR1、GARS、PARS、RPL6等7個基因普遍下調(diào)

11、；與蛋白質(zhì)伸展和折疊相關(guān)的HSPA8、HSPE1、CCT2等8個基因上調(diào)，HSPCB、HSPCA、CCT3等9個基因下調(diào)；與細(xì)胞信號轉(zhuǎn)導(dǎo)相關(guān)的RPS27、CASK、APP、HINT1等12個基因上調(diào)，SCGB1A1、RHO、CELSR1等5個基因下調(diào)。 7.實時定量PCR結(jié)果：HSV-2感染ECV304細(xì)胞6h時通過實時定量PCR檢測，可以看出SP100基因和RPS24基因處理組比對照組分別升高2.187和1.733倍，這與基因

12、芯片檢測結(jié)果(分別為2.097和2.980)基本一致，說明在HSV-2感染ECV304的過程中SP100基因和RPS24基因的表達(dá)顯著升高。RTP801基因處理組比對照組降低0.211倍，與基因芯片檢測結(jié)果(0.3263)基本一致，提示在HSV-2感染ECV304的過程中RTP801基因的表達(dá)顯著降低。HNRPA1基因處理組比對照組升高1.633倍，而基因芯片檢測結(jié)果為降低0.380，二者結(jié)果不一致，需要進(jìn)一步驗證。 結(jié)論：

13、 1.HSV-2可感染體外培養(yǎng)的ECV304細(xì)胞并導(dǎo)致ECV304細(xì)胞出現(xiàn)典型的細(xì)胞病變，主要引起細(xì)胞發(fā)生融合性和裂解性變化，未發(fā)現(xiàn)HSV-2對ECV304細(xì)胞的誘導(dǎo)凋亡現(xiàn)象。 2.應(yīng)用基因芯片技術(shù)研究了HSV-2對ECV304細(xì)胞基因表達(dá)的影響，共發(fā)現(xiàn)462條差異表達(dá)的基因，其中表達(dá)上調(diào)的基因318條，表達(dá)下調(diào)的基因144條。主要包括與細(xì)胞粘附、信號傳遞、細(xì)胞分裂、DNA復(fù)制、細(xì)胞周期、炎性反應(yīng)、凋亡、離子通道、細(xì)胞受體、

14、免疫和代謝等相關(guān)的基因。 3.通過生物信息學(xué)分析差異基因所參與的生物過程，結(jié)果發(fā)現(xiàn)462條差異基因共參與了237個生物過程，其中有79個生物過程具有顯著性差異(P＜0.05)。主要包括蛋白質(zhì)合成、信號傳遞、蛋白質(zhì)折疊、RNA剪接、離子通道、核糖體的合成和組裝、細(xì)胞呼吸、DNA和mRNA代謝等生物過程。進(jìn)一步分析發(fā)現(xiàn)，在這些差異基因中有多種基因可能參與了HSV致內(nèi)皮損傷、宮頸癌及動脈粥樣硬化，而其它多數(shù)首次發(fā)現(xiàn)的差異表達(dá)的基因在H

15、SV致病機(jī)制中的作用尚不清楚。盡管如此，通過基因芯片篩選異常表達(dá)的基因，為深入研究HSV導(dǎo)致內(nèi)皮損傷和動脈粥樣硬化的機(jī)制提供了有價值的線索。 4.應(yīng)用雙鏈DNA結(jié)合SYBRGreenⅠ的實時定量PCR驗證差異基因，定量結(jié)果與基因芯片檢測結(jié)果基本一致，說明了人全基因組寡核苷酸表達(dá)譜芯片在篩選差異表達(dá)基因中具有的可靠性。 通過對HSV-2感染ECV304細(xì)胞的生物學(xué)效應(yīng)研究，初步發(fā)現(xiàn)了在早期感染過程中的大量差異表達(dá)基因，為進(jìn)