RNAi大鼠樹突狀細(xì)胞MHC-I誘導(dǎo)小腸移植免疫耐受.pdf

1、本研究旨在通過(guò)siRNA 干擾大鼠樹突狀細(xì)胞中MHC-I 分子的表達(dá)，在同種異體小腸系膜淋巴結(jié)組織的刺激下，誘導(dǎo)移植免疫耐受細(xì)胞，即CD8+CD28-抑制性T 細(xì)胞，并初步探討相關(guān)的免疫學(xué)機(jī)制，為抑制性T 細(xì)胞過(guò)繼入大鼠同種異體小腸移植體內(nèi)后的研究奠定基礎(chǔ)。整個(gè)實(shí)驗(yàn)為三部分組成，內(nèi)容如下： 第一部分 大鼠樹突狀細(xì)胞的培養(yǎng)與鑒定 目的:建立穩(wěn)定的培養(yǎng)大鼠樹突狀細(xì)胞(DC)方法，并通過(guò)鑒定；探討大鼠小腸系膜淋巴組織通過(guò)同種異

2、體DC 和外周血單核細(xì)胞（PBMC）作用后刺激混合淋巴細(xì)胞增殖強(qiáng)度，以及腸系膜淋巴組織與DC 作用后MHC 類分子表達(dá)變化。 方法:分離培養(yǎng)SD 大鼠DC、PBMC、混合淋巴細(xì)胞，獲取Winstar 大鼠腸系膜淋巴結(jié)組織懸液。CCK-8 檢測(cè)法測(cè)定負(fù)載腸系膜淋巴組織抗原的DC 和PBMC，及負(fù)載腸系膜淋巴組織抗原和卵白蛋白（OVA）抗原的DC 對(duì)混合淋巴細(xì)胞刺激增殖能力；流式細(xì)胞儀分析腸系膜淋巴組織作用于DC 后，其MHC 類分

3、子表達(dá)變化。 結(jié)果:DC 培養(yǎng)至12 天時(shí)，OX62、CD86、CD80、MHC-I、MHC-II 抗原陽(yáng)性率分別是80.12％、82.30％、78.14％、83.92％、76.73％,并通過(guò)透射電鏡鑒定。獲得的大鼠小腸淋巴組織懸液中，淋巴細(xì)胞占91％，其余包括少量粒細(xì)胞、漿細(xì)胞、上皮細(xì)胞等；在各組中負(fù)載腸系膜淋巴組織抗原的DC 對(duì)混合淋巴細(xì)胞刺激增殖能力，均強(qiáng)于PBMC（P<0.05）；在DC 與混合淋巴細(xì)胞比例≥1∶100

4、各組中，負(fù)載腸系膜淋巴組織抗原的DC，對(duì)混合淋巴細(xì)胞刺激增殖能力，強(qiáng)于負(fù)載OVA 抗原的DC（P<0.05）；腸系膜淋巴細(xì)胞組織刺激DC 后，其MHC-I和II 類分子表達(dá)高于未加入抗原組。 結(jié)論:通過(guò)對(duì)大鼠骨髓干細(xì)胞的誘導(dǎo)分化，能成功的培養(yǎng)出DC； DC 抗原呈遞作用強(qiáng)于單核細(xì)胞；小腸系膜淋巴組織具有強(qiáng)抗原性；負(fù)載腸系膜淋巴組織抗原后的DC 高表達(dá)MHC-I、II 類分子。 第二部分 siRNA干擾大鼠樹突狀細(xì)胞MHC

5、-I類分子表達(dá) 目的:選擇出最佳siRNA 干擾序列，抑制DC 中MHC-I 類分子的表達(dá)；探討抑制MHC-I 類分子的DC 中IL-12、TNF-α和IL-6 表達(dá)的改變情況。 方法:應(yīng)用轉(zhuǎn)染熒光標(biāo)記siRNA，在10-200nM 濃度范圍內(nèi)，結(jié)合細(xì)胞死亡率與轉(zhuǎn)染率，檢測(cè)最佳siRNA 轉(zhuǎn)染濃度；在最佳干擾濃度時(shí)，通過(guò)流式細(xì)胞儀與rt-PCR 定量分析方法，對(duì)空白對(duì)照組、siRNA-1 組、siRNA-2 組、siRN

6、A-3 組和siRNA-4 組檢測(cè)，選擇出最有效抑制DC 中MHC-I 類分子表達(dá)的siRNA 序列；設(shè)立空白對(duì)照組、加入rrIL-10 對(duì)照組和有效干擾MHC-I表達(dá)的DC 組，應(yīng)用ELISA 方法比較各組中IL-12、TNF-α表達(dá)量,用rt-PCR方法比較各組IL-6 表達(dá)量。 結(jié)果:濃度為140 nM 時(shí)轉(zhuǎn)染率89.1％，細(xì)胞存活率為88.9％，確定此濃度為最佳siRNA 轉(zhuǎn)染濃度；流式細(xì)胞儀檢測(cè)分析，siRNA-2 組

7、中MHC-I 的表達(dá)量平均值最低，siRNA-2 組與空白對(duì)照組、siRNA-1 組、siRNA-3 組和siRNA-4 組中MHC-I 的表達(dá)量比較均存在統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（P<0.01）；rt-PCR 檢測(cè)siRNA-2 組MHC-I 表達(dá)量最低，siRNA-2組與siRNA-1 組、siRNA-3 組比較存在差異（P<0.05）；siRNA-2 組與siRNA-4組、空白對(duì)照組比較（P<0.001）統(tǒng)計(jì)學(xué)上有顯著差異； IL-12 與TN

8、F-α在空白對(duì)照組表達(dá)量明顯高于IL-10 組和siRNA 干擾組, 統(tǒng)計(jì)學(xué)差異有顯著性（P<0.01），而IL-10 組和siRNA 組表達(dá)量無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P＞0.05)； IL-6在空白對(duì)照組的表達(dá)量明顯低于siRNA 干擾組與IL-10 組（P<0.01）；siRNA組與IL-10 組比較，無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P＞0.05)。 結(jié)論:轉(zhuǎn)染DC 的最佳濃度為140nM；最有效抑制DC 中MHC-I 表達(dá)的序列是siRNA-2 組；

9、在抑制MHC-I表達(dá)的DC 細(xì)胞中，IL-12 與TNF-α表達(dá)量降低，IL-6 表達(dá)量升高，并與加入rrIL-10 因子培養(yǎng)組的表達(dá)量無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。 第三部分 RNA 干擾DC MHC-I 表達(dá)后誘導(dǎo)CD8+CD28-抑制性T 細(xì)胞 目的:通過(guò)siRNA干擾DC MHC-I表達(dá)后誘導(dǎo)CD8+CD28-抑制性T細(xì)胞（Ts）;探討Ts免疫學(xué)特性及Ts細(xì)胞中TGF-β、IFN-γ和CD25(IL-2R)表達(dá)量改變。

10、方法:Winstar大鼠腸系膜淋巴結(jié)組織液刺激siRNA干擾MHC-I表達(dá)的DC后，同磁珠法分離獲得SD大鼠CD8+T細(xì)胞共同培養(yǎng)反應(yīng)，再次通過(guò)磁珠法分離出CD8+CD28-抑制性T細(xì)胞；負(fù)載Winstar大鼠腸系膜淋巴組織抗原后，分別加入SD大鼠Ts細(xì)胞和SD大鼠混合T8細(xì)胞后，與SD大鼠混合淋巴細(xì)胞反應(yīng)、負(fù)載腸系膜淋巴組織抗原和卵白蛋白（OVA）抗原的Ts與混合淋巴細(xì)胞反應(yīng)以及rrIL-2與同種異體抗原存在或不存在時(shí)，Ts細(xì)胞在混合

11、淋巴細(xì)胞反應(yīng)中特性變化，均以CCK-8檢測(cè)法測(cè)定細(xì)胞增殖情況；設(shè)定CD8+CD28-T細(xì)胞組、CD8+CD28+T細(xì)胞組和混合T細(xì)胞組，應(yīng)用RT-PCR方法檢測(cè)TGF-β、IFN-γ表達(dá)，流式細(xì)胞儀檢測(cè)CD25(IL-2R)表達(dá)。 結(jié)果:磁珠法分離獲取SD大鼠脾臟中的CD8+T細(xì)胞，純度為92.33％；誘導(dǎo)獲得CD8+CD28-T細(xì)胞純度85.03％；CD8+CD28-T細(xì)胞組和T8混合淋巴細(xì)胞組進(jìn)行MLR后比較，除總細(xì)胞數(shù)與T

12、s細(xì)胞或?qū)φ誘8細(xì)胞數(shù)比例10：1外, 各組間差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.01），T8混合淋巴細(xì)胞組細(xì)胞增殖能力明顯強(qiáng)于Ts組，隨著Ts細(xì)胞數(shù)的增多，抑制混合淋巴細(xì)胞增殖作用增強(qiáng)，隨著T8混合淋巴細(xì)胞的增多，促混合淋巴細(xì)胞增殖能力增強(qiáng)； Ts細(xì)胞與腸系膜淋巴細(xì)胞組、OVA組反應(yīng)并進(jìn)行MLR，總細(xì)胞數(shù)與Ts細(xì)胞數(shù)比例為1：1和2.5：1時(shí)，OVA組增殖量高于腸系膜淋巴細(xì)胞組（P<0.05），在5：1和10：1時(shí)，OVA組增殖量顯著高于腸系膜

13、淋巴細(xì)胞組（P<0.01）；聯(lián)合Winstar大鼠腸系膜淋巴組織細(xì)胞液或單獨(dú)應(yīng)用rrIL-2因子，刺激SD大鼠Ts細(xì)胞和脾臟細(xì)胞混合細(xì)胞，細(xì)胞增殖反應(yīng)無(wú)差異(P>0.05)；CD8+CD28-Ts細(xì)胞組較CD8+CD28+T細(xì)胞組、混合T細(xì)胞組，TGF-β、IFN-γ表達(dá)量升高(P<0.05)，IL-2R表達(dá)量明顯降低(P<0.05)。 結(jié)論:siRNA干擾DC中MHC-I表達(dá)能誘導(dǎo)出CD8+CD28-抑制性T細(xì)胞；Ts細(xì)胞能誘