癲癇反復(fù)發(fā)作、腦損傷以及卡馬西平對(duì)大鼠腦內(nèi)P-糖蛋白表達(dá)及調(diào)節(jié)的影響.pdf

1、目的：盡管不斷有新的抗癲癇藥物(antiepilepticdrugs，AEDs)用于臨床，但是仍有近30％的癲癇患者不能控制發(fā)作而成為難治性癲癇，其主要的臨床特征是同時(shí)對(duì)多種結(jié)構(gòu)和作用機(jī)制完全不同的AEDs均產(chǎn)生耐藥，即多藥耐藥(multipledrugresistance，MDR)，表明難治性癲癇的耐藥機(jī)制是一種非特異性機(jī)制。第一個(gè)被發(fā)現(xiàn)與腫瘤MDR形成機(jī)制有關(guān)的藥物外流轉(zhuǎn)運(yùn)體是P-糖蛋白(P-glycoprotein，P-gp)，由

2、mdr1基因編碼。受腫瘤非特異性MDR機(jī)制的啟示，1995年首次發(fā)現(xiàn)臨床難治性癲癇患者手術(shù)切除的病變腦組織存在P-gp的過(guò)表達(dá)，并在多種急、慢性癲癇動(dòng)物模型中得到證實(shí)，但是目前對(duì)難治性癲癇患者P-gp過(guò)表達(dá)的機(jī)制了解較少。部分來(lái)自臨床流行病學(xué)的資料顯示，癲癇的反復(fù)發(fā)作、腦損傷以及AEDs的應(yīng)用是除個(gè)體遺傳因素外影響難治性癲癇患者mdr1/P-gp表達(dá)的三種最重要因素。然而，上述三種因素在對(duì)P-gp的表達(dá)影響中哪種因素處于主要地位、是否同

3、時(shí)發(fā)揮作用、三種因素間的相互關(guān)系如何、參與P-gp表達(dá)的調(diào)節(jié)因素有哪些以及P-gp的亞細(xì)胞定位等，目前都還缺乏了解。 本實(shí)驗(yàn)擬通過(guò)同時(shí)建立癲癇反復(fù)發(fā)作模型-戊四氮(Pentylenetetrazol，PTZ)點(diǎn)燃模型、大腦中動(dòng)脈永久阻塞(Middlecerebralarteryocclusion，MCAO)腦缺血缺氧損傷模型以及AED卡馬西平(carbamazepine，CBZ)干預(yù)三種模型，研究上述三種因素對(duì)P-gp表達(dá)的影響

4、及相互關(guān)系；確定P-gp的表達(dá)部位及其功能聯(lián)系；分析低氧誘導(dǎo)因子-1α(Hypoxiainduciblefactor-1α，HIF-1α)表達(dá)對(duì)mdr1/P-gp表達(dá)的調(diào)節(jié)作用。從而為指導(dǎo)臨床用藥和尋求通過(guò)阻斷mdr1基因編碼蛋白-P-gp的高表達(dá)以減少抗癲癇藥物耐藥性形成、提高藥物療效以及開(kāi)發(fā)新型AEDs提供第一手的實(shí)驗(yàn)資料和理論依據(jù)。 方法：1實(shí)驗(yàn)動(dòng)物及分組：健康雌性SD大鼠116只，隨機(jī)分為3組：PTZ點(diǎn)燃模型組(42只)

5、、大腦中動(dòng)脈永久阻塞模型組(52只)、AED-CBZ應(yīng)用組(22只)。 2模型制備：2.1PTZ點(diǎn)燃模型組：隨機(jī)分為對(duì)照組(6只)和實(shí)驗(yàn)組(36只)。實(shí)驗(yàn)組分2h、4h、12h、24h、48h、1w組，每組6只；腹腔注射戊四氮40mg/kg，每日2次。對(duì)照組同時(shí)注射等劑量的生理鹽水。給藥后觀察30～60min。行為學(xué)判斷標(biāo)準(zhǔn)按照Smialowki6級(jí)記分法。點(diǎn)燃成功標(biāo)準(zhǔn)：給藥后連續(xù)出現(xiàn)3次Ⅳ級(jí)或Ⅴ級(jí)發(fā)作。 2.2MCAO

6、模型組：隨機(jī)分為3組：對(duì)照組(5只)、假手術(shù)組(5只)和模型組(42只)。模型組分為缺血2h組、6h組、12h組、24h、48h、72h組，每組各7只。采用線栓法制作MCAO模型；假手術(shù)組，除不插線外，其余操作相同；對(duì)照組不做任何處置。模型完成2h后參考Longa和Bederson的5分制評(píng)分方法進(jìn)行神經(jīng)功能缺失體征評(píng)分。模型成功標(biāo)準(zhǔn)：術(shù)后評(píng)分≥1分。 2.3CBZ干預(yù)組：隨機(jī)分為對(duì)照組(4只)和實(shí)驗(yàn)組(18只)。實(shí)驗(yàn)組分為1w

7、、2w、4w組，每組各6只；給藥量：人每日最大劑量(20mg/kg)×鼠體重(kg)×6.25(由體表面積換算得到)。給藥方法：每日一次，早8：00～10：00灌胃給藥；對(duì)照組同時(shí)給予等量的生理鹽水。并分別選取2w和4w組各4只，熒光偏振檢測(cè)法測(cè)定血藥濃度的谷濃度。 3.P-gp和HIF-1α檢測(cè)：所有實(shí)驗(yàn)動(dòng)物均在相應(yīng)的時(shí)間點(diǎn)灌殺、取腦組織、切片，免疫組織化學(xué)SP法檢測(cè)P-gp和HIF-1α的表達(dá)情況，并分別和神經(jīng)元的特異性標(biāo)記

8、物-NeuN以及星形膠質(zhì)細(xì)胞的特異性標(biāo)記物-GFAP進(jìn)行DAB和TMB進(jìn)行雙重標(biāo)記染色，確定二者的表達(dá)部位。 4.統(tǒng)計(jì)學(xué)方法：同一組不同時(shí)間點(diǎn)行單因素方差分析。結(jié)果：1.行為學(xué)表現(xiàn)：1.1PTZ點(diǎn)燃模型組：動(dòng)物除2只死于癲癇持續(xù)狀態(tài)外，其余動(dòng)物均全部點(diǎn)燃，點(diǎn)燃成功率95％。對(duì)照組無(wú)癲癇發(fā)作。 1.2大腦中動(dòng)脈阻塞模型組：動(dòng)物24h和48h組，分別有2只和4只死亡。模型成功率為80％。假手術(shù)組和對(duì)照組無(wú)行為異常表現(xiàn)。

9、 1.3CBZ干預(yù)組：除3只動(dòng)物血藥濃度高于12.00μg/ml，2只動(dòng)物血藥濃度低于4.00μg/ml，其余均在有效血藥濃度范圍內(nèi)：4.34～10.65μg/ml(有效血藥濃度范圍4.00～12.00μg/ml)。模型組和對(duì)照組相比無(wú)行為異常表現(xiàn)。 2.P-gp和HIF-1α的表達(dá)和分布：2.1對(duì)照組：二者零星分布于血管內(nèi)皮細(xì)胞，并和特異性內(nèi)皮細(xì)胞標(biāo)記物-ECA進(jìn)行免疫組織化學(xué)雙標(biāo)證實(shí)；腦實(shí)質(zhì)細(xì)胞上未見(jiàn)表達(dá)。 2.2

10、PTZ點(diǎn)燃模型組：P-gp和HIF-1α的免疫陽(yáng)性物質(zhì)同時(shí)在發(fā)作后2h開(kāi)始出現(xiàn)，4h達(dá)到高峰，以海馬CA1區(qū)明顯，隨后開(kāi)始回落，1w后降至對(duì)照組水平。主要分布于海馬和皮層細(xì)胞的細(xì)胞膜及細(xì)胞漿。P-gp和HIF-1α在血管內(nèi)皮細(xì)胞的表達(dá)和對(duì)照組無(wú)差異。 2.3MCAO模型組：動(dòng)物缺血后2h已經(jīng)出現(xiàn)在損傷側(cè)皮層和紋狀體的血管內(nèi)皮細(xì)胞和腦實(shí)質(zhì)細(xì)胞，腦實(shí)質(zhì)細(xì)胞P-gp和HIF-1α的表達(dá)主要存在于細(xì)胞膜和細(xì)胞質(zhì)；并迅速達(dá)到高峰，隨后逐漸

11、減少，而周?chē)吘墔^(qū)域開(kāi)始增多，以血管內(nèi)皮細(xì)胞表達(dá)增多明顯；直到72h不能被檢測(cè)到，損傷對(duì)側(cè)皮層和紋狀體未見(jiàn)血管內(nèi)皮細(xì)胞和腦實(shí)質(zhì)細(xì)胞的表達(dá)。 2.4CBZ干預(yù)組：全部動(dòng)物P-gp和HIF-1α表達(dá)散在分布于血管內(nèi)皮細(xì)胞，腦實(shí)質(zhì)細(xì)胞未見(jiàn)其表達(dá)，和對(duì)照組相比，有增多趨勢(shì)，但無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。 2.5P-gp和HIF-1α的表達(dá)部位：二者與神經(jīng)元特異性標(biāo)記物(Neu-N)的免疫組化雙標(biāo)結(jié)果證實(shí)，點(diǎn)燃模型組和缺血模型組動(dòng)物的P-gp和

12、HIF-1α均共存于神經(jīng)元，且其表達(dá)部位和分布模式非常相似，提示HIF-1α可能參與了P-gp的表達(dá)調(diào)節(jié)。 結(jié)論：本研究在成功建立三種動(dòng)物模型的基礎(chǔ)上，通過(guò)比較三種因素對(duì)P-gp的影響，分析P-gp和HIF-1α表達(dá)的關(guān)系，得出以下結(jié)論： 1無(wú)神經(jīng)毒性的PTZ的點(diǎn)燃模型操作簡(jiǎn)單、成功率高，能更好地反映癲癇的反復(fù)發(fā)作對(duì)P-gp表達(dá)的影響。 2在大鼠PTZ點(diǎn)燃模型中發(fā)現(xiàn)，癲癇的反復(fù)發(fā)作可以誘導(dǎo)海馬和皮層腦實(shí)質(zhì)細(xì)胞-神

13、經(jīng)元P-gp的表達(dá)。 3在線栓法MCAO模型中發(fā)現(xiàn)，腦組織缺血、缺氧可以誘導(dǎo)損傷同側(cè)皮質(zhì)和紋狀體區(qū)的血管內(nèi)皮細(xì)胞和神經(jīng)元P-gp的表達(dá)明顯增多。 4CBZ的應(yīng)用對(duì)P-gp的表達(dá)無(wú)顯著影響。 5癲癇的反復(fù)發(fā)作、腦缺血缺氧性損傷對(duì)P-gp的表達(dá)存在表達(dá)時(shí)限和表達(dá)部位上的不同，以缺血缺氧性腦損傷的誘導(dǎo)作用最為明顯，其次是癲癇的反復(fù)發(fā)作。從病理生理學(xué)的角度考慮，引起P-gp表達(dá)變化的原因可能和缺氧有關(guān)。 6在PT