大鼠胰島β細胞P糖蛋白的表達及功能研究.pdf

1、目的：早期研究顯示在小鼠胰島B細胞中有一種與P糖蛋白（也稱為多藥耐藥蛋白1，Multidrug Resistantance Protein1，MDR1）相似的65kDa大小的膜蛋白，且借助膜片鉗技術發(fā)現此蛋白有類似磺脲類受體的功能，可促進胰島素顆粒釋放。本課題目的首先探測大鼠胰島B細胞中mini-P糖蛋白存在的可能性，并使用拮抗劑及RNA干擾技術進行該蛋白的功能研究，分析其在胰島素兩相分泌中的作用。
　　 方法：（1）經膽管不離

2、體灌注膠原酶V消化分離Wistar大鼠胰島；INS-1細胞培養(yǎng)。分別提取大鼠胰島、胰腺及INS-1細胞中的總RNA，針對MDR1特異基因序列abcbIb的3’末端及5’末端設計多對引物，進行RT-PCR；萃取大鼠胰島及INS-1細胞蛋白，以MDR1特異性抗體（C219）進行免疫印跡實驗，探測目的蛋白的存在。（2）針對P糖蛋白特異基因序列（abcbIb）設計寡核苷酸序列，使用siRNA干擾技術孵育胰島；轉染效率的觀察分別采用熒光顯微鏡觀察

3、，real-time PCR法測定目的基因的表達量及Western Blot法測定蛋白表達量的變化；進行葡萄糖刺激的胰島素釋放實驗，采用放免法測定RNA干擾后大鼠胰島的胰島素兩相分泌的變化。（3）建立高糖培養(yǎng)大鼠胰島凋亡的模型，采用real-time PCR法測定siRNA干擾后，凋亡基因表達的變化，評價RNA干擾對于胰島凋亡的影響，進一步分析目的蛋白在胰島素兩相分泌中的作用。（4）使用MDR1特異性拮抗劑（環(huán)孢菌素A）干預大鼠胰島，放

4、免法測定胰島素的兩相分泌。
　　 結果：（1）RT-PCR實驗提取的大鼠胰島、胰腺及INS-1細胞中均擴增出了相應的目的片段，且在胰島中的表達量較胰腺及INS-1細胞中表達量大。免疫印跡實驗中，使用C219在胰島勻漿蛋白中探測到65kDa大小的蛋白，在INS-1細胞蛋白萃取液中探測到了160kDa大小的蛋白。（2）在RNA干擾實驗中，轉染后48小時的胰島于熒光顯微鏡下觀察可見90％的胰島均呈現紅色熒光，提示轉染成功；Wester

5、n Blot實驗結果提示在空白組、實驗組及陰性對照組，使用C219均探測到了65kDa大小的蛋白，且實驗組較空白組及陰性對照組蛋白表達量下調，而空白組及陰性對照無明顯變化；siRNA干擾后abcbI6基因的表達量實驗組的較陰性及空白組減少，陰性組及空白組兩組無變化；與abcbIb基因相似的abcbIa基因的表達量在三組中無變化，胰島素合成相關基因insuin1、insulin2及胰高血糖素合成基因glucagon表達量無變化；siRNA

6、干擾后，三組胰島素分泌均呈現兩相分泌，實驗組的胰島素一相及二相分泌較空白組及陰性對照組均受損。（3）高糖孵育后高糖組casp3及bax基因的表達量較正常組上調，高糖組Bcl-2基因的表達量較正常組下調，而Bcl-xl基因在兩組中表達無差異；siRNA干擾后casp3 bax Bcl-2及Bcl-xl基因表達量在實驗組、陰性對照組及空白組中的表達量均無變化。（4）在體外胰島刺激實驗中，MDR1拮抗劑環(huán)孢菌素A，抑制了胰島素第二時相分泌，但

7、胰島素第一時相分泌無明顯變化。
　　 結論：（1）在INS-1細胞中有全長的P糖蛋白的表達，在大鼠胰島中有mini-P糖蛋白的表達。P糖蛋白的表達不同，提示著二者可能具有不同的生物學功能。在INS-1細胞中，P糖蛋白可能主要與耐藥相關，而在胰島細胞中，mini的P糖蛋白可能主要與胰島素的分泌釋放相關。（2）siRNA干擾后，目的基因abcbIb表達量下調，胰島素的兩相分泌均受損，而凋亡相關基因及胰島素合成相關基因的表達無改變，提

8、示siRNA干擾后未直接影響胰島素的合成，且胰島素的兩相分泌受損并非通過凋亡途徑，進一步支持了前述觀點，P糖蛋白或mini-P糖蛋白影響胰島素顆粒的酸化成熟，調節(jié)胰島素的兩相分泌。（3）使用環(huán)孢菌素A干預胰島后，胰島素的一相分泌未受影響，而胰島素的二相分泌明顯受抑制，推測其拮抗P糖蛋白或mini-P糖蛋白，從而影響胰島素顆粒的酸化成熟，表現為胰島素的二相分泌受損。（4）深入研究mini-P糖蛋白的結構及功能，可為新的降糖藥物的研發(fā)提供理