放線菌素D-TNF-α誘導(dǎo)小鼠胰島微血管內(nèi)皮細(xì)胞凋亡的研究.pdf

1、胰島是高度血管化的微器官，胰島微血管內(nèi)皮細(xì)胞（islet microvascular endothelial cells，IMEC）是胰島微血管的主要組成部分，不僅具有血管內(nèi)皮細(xì)胞的一般性質(zhì)，如血管生成、止血的作用，而且擔(dān)負(fù)著營(yíng)養(yǎng)β細(xì)胞、分泌誘導(dǎo)胰島細(xì)胞生長(zhǎng)發(fā)育信號(hào)分子的功能。既往已有研究證明，β細(xì)胞功能衰竭很可能是胰島微血管病變的表現(xiàn)[2]，而過(guò)量的IMEC凋亡是引起胰島微血管病變的重要因素。正常的情況下，血管內(nèi)皮細(xì)胞的凋亡與生成處于

2、一個(gè)動(dòng)態(tài)平衡的狀態(tài)，但長(zhǎng)期處于一種慢性的低度亞臨床炎癥狀態(tài)的2型糖尿病患者，尤其發(fā)生酮癥酸中毒、急性感染時(shí)，短時(shí)間內(nèi)啟動(dòng)炎癥級(jí)聯(lián)反應(yīng)，導(dǎo)致胰島微血管內(nèi)皮細(xì)胞大量凋亡，從而破壞動(dòng)態(tài)平衡，抑制了血管的生成，最終導(dǎo)致β細(xì)胞損傷。據(jù)此，深入研究胰島內(nèi)皮細(xì)胞病理生理改變的機(jī)制，建立有效阻斷損傷通路的途徑，對(duì)于保護(hù)胰島細(xì)胞，阻止糖尿病的發(fā)生發(fā)展具有積極意義。 為了更好地觀測(cè)炎癥起始細(xì)胞因子TNF-α、放線菌素D/TNF-α對(duì)IMEC的影響，

3、以及IMEC上TNFR1的表達(dá)和阻斷凋亡通路的機(jī)制，本試驗(yàn)在建立小鼠IMEC凋亡模型的基礎(chǔ)上，以小鼠IMEC為研究對(duì)象，探討炎癥因子與胰島微血管內(nèi)皮細(xì)胞凋亡的關(guān)系，以期為防治糖尿病提供新的實(shí)驗(yàn)依據(jù)。 目的: 研究腫瘤壞死因子1型受體（TNFR1）在小鼠IMEC上的表達(dá)，觀察TNF-α，ActD/TNF-α刺激對(duì)IMEC的作用及其可能的損傷機(jī)制，建立小鼠IMEC的凋亡模型，為干預(yù)糖尿病及尋找新的治療靶點(diǎn)提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

4、 方法: 1.以美國(guó)國(guó)立細(xì)胞庫(kù)（American Type Culture Collection，ATCC）MS-1細(xì)胞作為試驗(yàn)對(duì)象進(jìn)行培養(yǎng)和誘導(dǎo)凋亡。將MS-1細(xì)胞置于含5%新生牛血清的高糖DMEM培養(yǎng)基中，37℃、5%CO2飽和濕度下培養(yǎng)。細(xì)胞貼壁生長(zhǎng)，鋪滿后以0.25%胰酶消化傳代，每3d傳代1次。 2.細(xì)胞爬片及免疫熒光染色：細(xì)胞經(jīng)消化后，用含5%新生牛血清的培養(yǎng)基將細(xì)胞調(diào)成的細(xì)胞懸液，接種于6孔板中，待細(xì)胞生

5、長(zhǎng)狀態(tài)良好時(shí)終止培養(yǎng)。4%多聚甲醛固定爬片30 min后PBS沖洗，用0.1%Triton X-100處理后以正常羊血清工作液封閉，傾去血清，滴加一抗即兔抗鼠TNFR1多克隆抗體，過(guò)夜后滴加二抗即FITC標(biāo)記羊抗兔IgG，室溫孵育2h。封片后在熒光顯微鏡下觀察、拍照。 3.透射電鏡觀察：將細(xì)胞隨機(jī)分為3組：①正常對(duì)照組、②TNF-α組（TNF-α終濃度為100ng/ml，以下括號(hào)內(nèi)濃度均指終濃度）、③ActD/TNF-α組（在2

6、0ng/mlActD預(yù)處理15min后再加入TNF-α）。細(xì)胞經(jīng)藥物作用24h后，再用胰酶消化、PBS洗滌、離心、棄上清后以4%、PH7.4的戊二醛固定，雙鉛染色后置透射電鏡下觀察細(xì)胞的形態(tài)學(xué)變化。 4.細(xì)胞毒實(shí)驗(yàn)分為兩部分：將細(xì)胞接種于96孔板中，每孔100μl，在37℃、5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24h，每組6個(gè)復(fù)孔。用不同濃度的TNF-α（每孔加100μl）37℃、5%CO2孵箱中刺激24小時(shí)后，每孔加MTT溶液（5g/l）2

7、0μl，37℃孵育4h，吸除培養(yǎng)基，每孔加入150μl二甲亞楓（DMSO）振蕩10min，選擇570nm波長(zhǎng)測(cè)吸光度以判斷細(xì)胞活力。同時(shí)，設(shè)不加細(xì)胞只加培養(yǎng)液的空白對(duì)照孔，比色時(shí)以空白孔調(diào)零。MTT自動(dòng)比色法所測(cè)的吸光度反映細(xì)胞的損傷情況。 4.1 TNF-α體外對(duì)IMEC生長(zhǎng)的細(xì)胞毒性作用 用不同濃度的TNF-α作用于對(duì)MS-1并觀察其對(duì)MS-1生長(zhǎng)的影響。實(shí)驗(yàn)分組：control組為正常對(duì)照組，細(xì)胞未經(jīng)任何處理；TN

8、F-α組加入不同濃度的TNF-α（20，40，80，100ng/ml）；ActD/TNF-α組在20ng/ml ActD預(yù)處理后加入與上組相對(duì)應(yīng)的濃度的TNF-α；作用24小時(shí)后，用MTT法檢測(cè)細(xì)胞毒作用， 4.2 Ac-DEVD-CHO拮抗ActD/TNF-α對(duì)IMEC的細(xì)胞毒作用 用MTT法檢測(cè)Ac-DEVD-CHO對(duì)ActD/TNF-α的拮抗作用。實(shí)驗(yàn)分組：A組為正常對(duì)照組，細(xì)胞未經(jīng)任何處理；B組為僅加TNF-α（

9、100ng/ml）；C組為ActD（20ng/ml）預(yù)處理后加入TNF-α（100ng/ml）；D組為加入Ac-DEVD-CHO（200μmol/L）后15min加入ActD/TNF-α，孵育24h后，用MTT法檢測(cè)細(xì)胞毒作用。 5.流式細(xì)胞儀檢測(cè)細(xì)胞凋亡：將細(xì)胞接種于6孔板后，試驗(yàn)分組：TNF-α組為僅加入TNF-α（100ng/ml）；Ac-DEVD-CHO組為僅加入Ac-DEVD-CHO（200μmol/L）；ActD/T

10、NF-α組為在ActD（20ng/ml）預(yù)處理后加入TNF-α（100ng/ml）；ActD/TNF-α/Ac-DEVD-CHO組再分3組，為分別加入不同濃度Ac-DEVD-CHO（50，100，200μmol/L）后15min加入ActD/TNF-α；正常對(duì)照組的細(xì)胞未經(jīng)任何處理。各組培養(yǎng)24h后用胰酶消化，冰PBS洗滌后加入Annexin V-FITC和PI染色，室溫避光孵育10 min，上機(jī)測(cè)試。每一實(shí)驗(yàn)組檢測(cè)5份標(biāo)本，Cellf

11、it軟件收集10000個(gè)細(xì)胞，Annexin V-FITC單染陽(yáng)性的百分率即為細(xì)胞凋亡百分率。 結(jié)果: 1.免疫熒光染色后TNFR1在MS-1細(xì)胞呈較強(qiáng)黃綠色熒光，對(duì)照組無(wú)表達(dá)。 2.透射電鏡觀察可見正常對(duì)照組和TNF-α組細(xì)胞形態(tài)差別不明顯，多數(shù)為正常形態(tài)的細(xì)胞。ActD/TNF-α組以凋亡細(xì)胞為多，凋亡細(xì)胞膜空泡化，細(xì)胞體積明顯變小，細(xì)胞器結(jié)構(gòu)形態(tài)混沌，內(nèi)質(zhì)網(wǎng)與胞膜融合而出芽，核膜清晰，可見大量凋亡小體。

12、 3.用20、40、80、100ng/ml TNF-α作用于MS-1細(xì)胞24h后，在20、40、80、100ng/ml TNF-α作用濃度下，ActD/TNF-α組的吸光度（OD值）依次為0.42±0.04、0.31±0.04、0.20±0.06、0.09±0.06，相同TNF-α濃度下TNF-α組的OD值依次為0.50±0.05、0.48±0.05、0.46±0.07、0.45±0.05。結(jié)果顯示ActD/TNF-α組OD值顯著低

13、于TNF-α組（在20ng/mlTNF-α組中，P=0.015；在40、80、100ng/mlTNF-α組中P=0.000）。Control組的OD值為0.50±0.05，與不同濃度TNF-α組的OD值兩兩相比無(wú)顯著差異（P>0.05）。Control組的OD值顯著高于不同濃度的ActD/TNF-α組（與20ng/ml ActD/TNF-α組相比P=0.025；與40、80、100ng/mlActD/TNF-α組相比P=0.000）。

14、 4.比較20、40、80、100ng/ml4個(gè)不同TNF-α濃度的ActD/TNF-α組的OD值顯示，MS-1細(xì)胞被ActD致敏15min后，其OD值與TNF-α濃度間存在顯著負(fù)相關(guān)關(guān)系（r=-0.923，P=0.000）。TNF-α作用濃度和干預(yù)因素之間存在交互效應(yīng)（F=12.083，P=0.000） 5.研究Ac-DEVD-CHO拮抗ActD/TNF-α對(duì)IMS-1細(xì)胞的細(xì)胞毒作用時(shí)顯示，TNF-α組、ActD/TN

15、F-α組、Ac-DEVD-CHO/ActD/TNF-α組于藥物作用24h后，TNF-α組、Ac-DEVD-CHO/ActD/TNF-α組的OD值分別為0.452±0.0630、0438±0.083，依次與正常對(duì)照組相比，均無(wú)顯著差異（P=0.618，0.620）。 6.研究Ac-DEVD-CHO對(duì)ActD/TNF-α誘導(dǎo)IMEC凋亡的保護(hù)作用時(shí)顯示，Ac-DEVD-CHO組、 TNF-α組的凋亡率分別為（11.13±1.13）%

16、、（11.39±1.09）%，分別與正常對(duì)照組相比，均無(wú)顯著差異（P=0.550和P=0.361）。 7.比較3個(gè)不同濃度的ActD/TNF-α/Ac-DEVD-CHO組的凋亡率后發(fā)現(xiàn)MS-1細(xì)胞的凋亡率與Ac-DEVD-CHO濃度間存在顯著負(fù)相關(guān)關(guān)系（r=-0.946，P=0.000），即MS-1細(xì)胞的凋亡率隨著Ac-DEVD-CHO濃度的升高而降低。 結(jié)論: 1、首次在小鼠胰島微血管內(nèi)皮細(xì)胞株MS-1上觀測(cè)到

17、TNF-α受體（TNFR1），并以ActD/TNF-α誘導(dǎo)MS-1細(xì)胞而建立IMEC的凋亡模型。 2、僅以TNF-α作用未引發(fā)MS-1細(xì)胞的形態(tài)學(xué)變化，但經(jīng)ActD預(yù)處理后細(xì)胞所發(fā)生的變化符合凋亡的形態(tài)學(xué)改變，且MS-1細(xì)胞在一定濃度范圍（20～100 ng/ml）TNF-α的作用下，隨著TNF-α作用濃度的增加，細(xì)胞活力逐漸下降，并在一定的范圍內(nèi)呈劑量.效應(yīng)關(guān)系。提示在胰島微血管內(nèi)皮細(xì)胞被致敏或其他條件下，炎癥因子TNF-α可