Intermedin-,1-53-抗大鼠心肌纖維化作用及其機(jī)制研究.pdf

1、目的：心肌纖維化是多種心臟疾病發(fā)展到一定階段的共同病理改變，是心室重構(gòu)的主要表現(xiàn)之一。作為心血管活性肽類物質(zhì)Intermedin1-53(IMD1-53)在改善心臟功能、抗心肌缺血/再灌注損傷等心血管疾病中發(fā)揮重要作用。但它是否具有抗心肌纖維化的作用及其作用機(jī)制尤其是信號轉(zhuǎn)導(dǎo)方面機(jī)制尚未清楚。因此本課題以心肌成纖維細(xì)胞為靶點(diǎn)細(xì)胞，從體內(nèi)外兩方面觀察IMD1-53抗心肌纖維化作用及信號轉(zhuǎn)導(dǎo)機(jī)制。 方法： 1．采用結(jié)扎大鼠左

2、冠狀動(dòng)脈前降支誘導(dǎo)心肌纖維化動(dòng)物模型，假手術(shù)組只穿線不結(jié)扎。4周后檢測心功能；HE染色、天狼星紅染色切片觀察心肌形態(tài)學(xué)變化；Western blot方法檢測Ⅰ、Ⅲ型膠原蛋白表達(dá)；RT-PCR、Western blot方法檢測左室非梗死區(qū)心肌IMD1-53、降鈣受體樣受體(calcitonin receptor-like receptor,CRLR)、受體活性修飾蛋白(receptor-activity-modifying protein

3、,RAMP)1/2/3基因和蛋白表達(dá)水平；通過放免法檢測血漿和左室非梗死區(qū)心肌的醛固酮含量，RT-PCR方法檢測左室非梗死區(qū)心肌組織醛固酮合成酶（CYP11B2）基因表達(dá)。 2．以新生SD大鼠心肌成纖維細(xì)胞（cardiac fibroblast，CFb)為研究對象，醛固酮（aldosterone，ALD）誘導(dǎo)增殖。采用MTT法觀察ALD對CFb增殖活性的影響；檢測細(xì)胞上清液中羥脯氨酸含量分析IMD1-53是否具有抗ALD誘導(dǎo)CF

4、b增殖的作用，以及用同樣方法觀察IMD1-53的同家系腎上腺髓質(zhì)素(adrenomedullin，ADM)受體拮抗劑ADM22-52和降鈣素基因相關(guān)肽(calcitonin gene-related peptide，CGRP)受體拮抗劑CGRP8-37是否可以抑制IMD1-53降低CFb增殖的作用；通過Western blot方法觀察IMD1-53對ALD誘導(dǎo)的CFb的p-ERK1/2蛋白表達(dá)的影響。 結(jié)果： 1. 結(jié)扎

5、大鼠左冠狀動(dòng)脈前降支4周可形成心肌纖維化動(dòng)物模型。測定結(jié)果顯示：與假手術(shù)組比較，模型組大鼠的心功能明顯降低(P<0.01～0.05)；天狼星紅染色發(fā)現(xiàn)心肌纖維化明顯增強(qiáng)；左室非梗死區(qū)心肌組織的Ⅰ、Ⅲ型膠原蛋白表達(dá)增加(P<0.05)；左室非梗死區(qū)心肌IMD1-53,CL、RAMP1/2/3的mRNA表達(dá)水平分別上調(diào)75％(P<0.01)，57％(P<0.05)，61％(P<0.01)，48％(P<0.05)和80％(P<0.05)，左室

6、非梗死區(qū)心肌CL、RAMP1/2/3蛋白表達(dá)水平分別上調(diào)108％、79％、80％和111％(P<0.01～0.05)；血漿和左室非梗死區(qū)心肌組織中醛固酮含量分別升高了1.32倍（P<0.01）和3.14倍（P<0.01）。左室非梗死區(qū)心肌組織CYP11B2 mRNA表達(dá)增加了44％(P<0.05)。2. ALD可誘導(dǎo)CFb增殖。測定結(jié)果顯示：與對照組比較，ALD刺激CFb 24h后，在ALD濃度為10-8～10-6mol/L范圍內(nèi)，可促

7、CFb增殖(P<0.01～0.05)，以ALD濃度為10-6mol/L時(shí)CFb MTT產(chǎn)物的OD值最大(P<0.01)；IMD1-53可抑制ALD誘導(dǎo)的CFb增殖，檢測羥脯氨酸（Hyp）含量明顯降低，且呈劑量依賴性，與ALD組比較有顯著性差異(P<0.01～0.05)；ADM22-52和CGRP8-37均可減弱IMD1-53對ALD的作用；ALD可誘導(dǎo)CFb的p-ERK蛋白表達(dá)，ALD作用5 min，p-ERK蛋白表達(dá)開始升高，作用10

8、 min，p-ERK蛋白表達(dá)達(dá)最高值；與對照組比較，IMD1-53可抑制ALD誘導(dǎo)的CFb的p-ERK蛋白的表達(dá)（P<0.05）。 結(jié)論： 1. 結(jié)扎大鼠左冠狀動(dòng)脈前降支4周可形成心肌纖維化動(dòng)物模型；心肌纖維化大鼠心室肌IMD1-53，CRLR、RAMP1/2/3的mRNA及蛋白表達(dá)水平分別上調(diào)，血漿和心肌組織中醛固酮含量分別升高，CYP11B2 mRNA表達(dá)明顯上調(diào)。 2. ALD對CFb活力的影響在一定時(shí)間和

9、一定的濃度范圍內(nèi)呈現(xiàn)增加趨勢；IMD1-53在一定時(shí)間和一定的濃度范圍內(nèi)可以抑制ALD誘導(dǎo)的新生大鼠CFb的增殖；ADM的受體拮抗劑ADM22-52和CGRP的受體拮抗劑CGRP8-37均可減弱IMD1-53抑制CFb增殖的作用，提示IMD1-53可通過CGRP和ADM受體起作用抑制CFb增殖；ALD可激活細(xì)胞內(nèi)p-ERK這一與細(xì)胞增殖密切相關(guān)的信號物質(zhì)，IMD1-53能有效抑制ALD介導(dǎo)的p-ERK表達(dá)，提示IMD1-53可通過ERK