雙重抗肺纖維化基因嵌合重組體蛋白的研制.pdf

1、目的：中性粒細胞抑制因子(NIF)是整合素B2的專一性拮抗劑，能抑制中性粒細胞與內皮細胞的粘附和聚集，阻止白細胞的滲透和浸潤。角質細胞生長因子(KGF)是成纖維細胞生長因子家族中的一員，由間充質細胞分泌并特異性地作用于上皮細胞促進其生長繁殖。許多實驗均證明KGF和NIF在肺臟的發(fā)育、炎癥和修復中發(fā)揮重要的作用。針對NIF能夠抑制病理性自身免疫反應和KGF能夠修復損傷的肺泡上皮及抑制纖維化的功效，我們構建了這兩種細胞因子的基因嵌合重組體，

2、并進行表達，目的是研制能夠治療急性肺損傷和肺纖維化的重組蛋白，為進一步的研究和開發(fā)奠定基礎。方法：以8個甘氨酸作為鉸鏈區(qū)，運用over-lapPCR的方法將NIF與KGF連接，獲得雙重抗肺纖維化基因嵌合重組體NKM的基因序列。利用pET原核表達系統(tǒng)，在BL21Star(DE3)plysS大腸桿菌中高效表達NKM。經過測序、誘導表達、純化和Western-Blot等確證后，再對NKM的體內外活性進行測定。結果：本研究成功構建了雙重抗肺纖維

3、化基因重組嵌合體NKM；并在BL21Star(DE3)plysS大腸桿菌中表達量達到25％；經Western-Blot檢測有免疫活性；通過DEAE層析柱純化得到純度為80％的NKM；體外細胞活性測定表明，NKM對白細胞粘附有劑量依賴性的抑制作用，對成纖維細胞生長也有劑量依賴性的抑制作用；動物體內活性測定顯示，NKM抑制急性肺損傷后循環(huán)內白細胞的增加；病理解剖顯示NKM能明顯抑制博萊霉素誘導的肺炎和肺纖維化。結論：本實驗獲得了具有雙重功能