雙重靶效應(yīng)基因嵌合重組體的構(gòu)建與表達(dá).pdf

1、研究發(fā)現(xiàn)基質(zhì)細(xì)胞衍生因子（Stromal cell-derived factor-1，SDF-1）及其受體CXCR4（CXC chemokine receptor-4）是決定乳腺癌轉(zhuǎn)移的關(guān)鍵因子。我們對(duì)SDF-1進(jìn)行多位點(diǎn)定向遺傳改造，從中篩選出能與CXCR4高特異性結(jié)合，但不能激活CXCR4耦聯(lián)的G蛋白下游信號(hào)通路的拮抗劑。此拮抗劑通過(guò)競(jìng)爭(zhēng)性地阻礙野生型SDF-1與CXCR4的結(jié)合，破壞乳腺癌原發(fā)灶與遠(yuǎn)程特定轉(zhuǎn)移器官之間所存在的SDF

2、-1梯度，切斷乳腺癌轉(zhuǎn)移的潛在通路，從而抑制乳腺癌的轉(zhuǎn)移。近年來(lái)，小分子富含亮氨酸蛋白糖甙家族成員---飾膠蛋白（Decorin）因被證實(shí)是一強(qiáng)的腫瘤細(xì)胞生長(zhǎng)負(fù)性調(diào)節(jié)因子而成為腫瘤研究領(lǐng)域的熱點(diǎn)。研究表明Decorin通過(guò)特異性阻斷表皮生長(zhǎng)因子受體-2(HER-2)高表達(dá)而抑制癌細(xì)胞浸潤(rùn)性生長(zhǎng)。本研究的主要目的是將SDF-1的突變體通過(guò)人類IgG1抗體重鏈的鉸鏈區(qū)(IgG1 Heavy Chain Hinge Region,以下簡(jiǎn)稱Hi

3、nge)與Decorin連接而構(gòu)建雙重靶效應(yīng)基因嵌合重組體，以抑制乳腺癌的生長(zhǎng)和轉(zhuǎn)移。 一共構(gòu)建了三種嵌合基因SDF-1p2g-Hinge-Decorin（以下簡(jiǎn)稱p2gch），SDF-1p2g54-Hinge-Decorin（以下簡(jiǎn)稱p2g54ch）和SDF-wt-Gly×4-Decorin（以下簡(jiǎn)稱wtch）。P2gch的構(gòu)建方法為：以本室構(gòu)建的野生型hSDF-1基因?yàn)槊?，采用PCR定點(diǎn)突變的方法，將SDF-1的N端第二個(gè)

4、氨基酸Pro突變?yōu)镚ly，所形成的突變體SDF-1p2g再通過(guò)人工合成的Hinge與采用RT-PCR法從人骨髓中克隆的Decorin成熟肽編碼序列相連，即得到嵌合基因p2gch。P2g54ch是在構(gòu)建p2gch的基礎(chǔ)上采用PCR的方法進(jìn)一步使SDF-1 C端α-螺旋缺失而形成的嵌合基因p2g54ch。由于后來(lái)發(fā)現(xiàn)這兩種嵌合基因所表達(dá)的蛋白P2Gch和P2G54ch不夠穩(wěn)定，有分解現(xiàn)象，遂決定將SDF-1與Decorin之間的連接片斷Hi

5、nge替換為結(jié)構(gòu)更簡(jiǎn)單的四個(gè)甘氨酸（Gly-Gly-Gly-Gly）短肽，因而構(gòu)建了第三種嵌合體wtch，其構(gòu)建方法為：通過(guò)引物設(shè)計(jì)將 Gly×4直接連在野生型SDF-1基因（SDF-wt）的3-端，然后Gly×4再與PCR得到的Decorin連接即得到嵌合基因wtch。將構(gòu)建好的嵌合基因插入原核表達(dá)載體pET-30a(+)，轉(zhuǎn)入大腸桿菌BL21(DE3)，用IPTG誘導(dǎo)表達(dá)。由于突變型嵌合蛋白P2Gch和P2G54ch在N端帶有載體表

6、達(dá)的6×His標(biāo)簽，野生型嵌合蛋白WTch在C端帶有載體表達(dá)的6×His標(biāo)簽，因此三種嵌合蛋白均可在變性條件下用鎳柱親和層析進(jìn)行純化。純化產(chǎn)物用稀釋、透析和超濾法進(jìn)行復(fù)性，復(fù)性的蛋白用MTT法初步檢測(cè)其活性。 基因測(cè)序結(jié)果表明三種嵌合體構(gòu)建完全正確，SDS-PAGE檢測(cè)結(jié)果表明三種嵌合體均能在大腸桿菌BL21(DE3)中大量表達(dá)，表達(dá)產(chǎn)物主要以包涵體形式存在，Western-blot證實(shí)表達(dá)產(chǎn)物是目標(biāo)蛋白。表達(dá)產(chǎn)物在變性條件下用