鴨坦布蘇病毒的分離與鑒定及致病性研究.pdf

1、2010年4月以來(lái)，中國(guó)南部城市爆發(fā)了一種以產(chǎn)蛋鴨產(chǎn)蛋量急劇下降為特征的流行病，并迅速漫延到山東，河南等中部城市。2011年，該病被命名為“鴨坦布蘇病毒病”，該病感染率高，死亡率低，主要以產(chǎn)蛋量急劇下降為主要特征，肉鴨，雛鴨主要癥狀為站立困難，步態(tài)不穩(wěn)，給養(yǎng)禽業(yè)帶來(lái)了巨大損失。鴨坦布蘇病毒屬于黃病毒科黃病毒屬，同種屬病毒有登革熱病毒，黃熱病毒，西尼羅河病毒等危害人體健康的病毒，不排除鴨坦布蘇病毒感染哺乳動(dòng)物并引發(fā)疾病的可能性。鴨坦布蘇病

2、毒目前尚無(wú)有效的疫苗防治，并且其致病機(jī)理也尚不明確。因此，對(duì)鴨坦布蘇病毒基因結(jié)構(gòu)分析及致病性研究是十分必要的。
　　1.鴨坦布蘇病毒的分離與鑒定
　　本實(shí)驗(yàn)病料來(lái)自于湖北省麻城某發(fā)病鴨場(chǎng)。自然感染病鴨出現(xiàn)匍匐不能站立，劃水狀姿勢(shì)，產(chǎn)蛋量由50％下降至0。病鴨腦組織出現(xiàn)“血管袖套”“噬神經(jīng)元”等典型的非化膿性腦炎癥狀，脾組織淋巴細(xì)胞減少，卵泡粒膜與內(nèi)膜分離。將自然感染病鴨腦組織勻漿，經(jīng)RT-PCR初步鑒定為鴨坦布蘇病毒。病鴨腦

3、組織勻漿液經(jīng)尿囊腔接種10日齡鴨胚，發(fā)現(xiàn)病毒可導(dǎo)致鴨胚胚體出血，胚體變小，肝有黃色斑塊。收獲的病毒尿囊液感染DEF細(xì)胞，經(jīng)增殖后收集含病毒的細(xì)胞液。將收獲的病毒細(xì)胞液感染BHK細(xì)胞，感染后48h開(kāi)始出現(xiàn)細(xì)胞病變，BHK細(xì)胞出現(xiàn)圓縮，72h出現(xiàn)明顯的細(xì)胞病變。病毒的鴨胚半數(shù)致死量和蝕斑單位分別為10-4.42ELD50/0.3mL和4.72×107pfu/mL，BHK細(xì)胞的間接熒光試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)病毒出現(xiàn)在BHK細(xì)胞的細(xì)胞質(zhì)中，血凝試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)病毒不

4、凝集雞紅細(xì)胞。電子顯微鏡下觀察，病毒粒子為圓形，直徑為40～60nm，有囊膜。綜上可確定實(shí)驗(yàn)室分離的毒株為鴨坦布蘇病毒，并將其命名為MC株。
　　2.鴨坦布蘇病毒全序列的測(cè)定
　　RT-PCR測(cè)定病毒全序列，拼接后進(jìn)行分析。測(cè)得的病毒全基因組序列上傳GenBank并將其命名為MC株。鴨坦布蘇病毒MC株全基因組序列與黃病毒科黃病毒屬的代表毒株做遺傳進(jìn)化分析，發(fā)現(xiàn)其與Sitiawan virus處于同一分支，親緣性最近。同源性比

5、對(duì)發(fā)現(xiàn)，其與Sitiawan virus的同源性較高，為87.1％，與Yellow fevervirus的同源性最低，為53.1％。MC株全基因組序列長(zhǎng)10990bp，僅含有一個(gè)開(kāi)放性閱讀框，大小為10278bp，共編碼3425個(gè)氨基酸。蛋白裂解位點(diǎn)與其他黃病毒相似，閱讀框由3個(gè)結(jié)構(gòu)蛋白(PrM，C，E)和7個(gè)非結(jié)構(gòu)蛋白組成(NS1，NS2A，NS2B，NS3，NS4A，NS4B，NS5)。糖基化位點(diǎn)預(yù)測(cè)發(fā)現(xiàn)MC株在非結(jié)構(gòu)蛋白NS5的數(shù)

6、量與其他坦布蘇病毒有差異。RNAfold預(yù)測(cè)基因組非編碼區(qū)二級(jí)結(jié)構(gòu)發(fā)現(xiàn)，MC株與其他黃病毒相似，在5'端非編碼序列有大莖環(huán)結(jié)構(gòu)SLA，小莖環(huán)結(jié)構(gòu)SLB。3'非編碼區(qū)有莖環(huán)結(jié)構(gòu)3'SL。MC株在3'端非編碼區(qū)的保守序列與其他坦布蘇病毒相似性極高。蛋白序列同源性分析發(fā)現(xiàn)與其他鴨坦布蘇病毒的同源性均在97％以上。
　　3.MC株鴨坦布蘇病毒對(duì)麻鴨雛鴨的致病性
　　MC株鴨坦布蘇病毒接種7日齡的雛鴨，攻毒后7天，全部剖殺，將心，肝，