鴨坦布蘇病毒e蛋白基因的原核表達(dá)

1、鴨坦布蘇病毒E蛋白基因的原核表達(dá)?姬希文12，李雪松1，邊延峰3，李國新1，顏丕熙1，張七斤2，李澤君1(1.中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院上海獸醫(yī)研究所，上海200241；2.內(nèi)蒙古農(nóng)業(yè)大學(xué)獸醫(yī)學(xué)院，呼和浩特010018；3.天津生機(jī)集團(tuán)股份有限公司，天津300384）摘要：本研究利用RTPCR方法擴(kuò)增鴨坦布蘇病毒（DuckTembusuvirus，DTMUV）奉賢株（FX2010）的結(jié)構(gòu)蛋白E基因，并將其克隆至原核表達(dá)載體pET32a（），構(gòu)建重組

2、表達(dá)質(zhì)粒pET32aE。將其轉(zhuǎn)化受體菌E.coliBL21(DE3)感受態(tài)細(xì)胞，經(jīng)IPTG誘導(dǎo)進(jìn)行表達(dá)。SDSPAGE和Westernblot試驗(yàn)檢測結(jié)果表明，E基因在大腸桿菌中得到了表達(dá)，并且可與抗DTMUV的多克隆抗體發(fā)生特異性反應(yīng)。E基因的成功表達(dá)為DTMUV的診斷試劑盒、疫苗等的研制奠定基礎(chǔ)。關(guān)鍵詞：鴨坦布蘇病毒；E基因；克隆；表達(dá)中圖分類號：文獻(xiàn)標(biāo)志碼：A文章編號：16746422（2012）02000000EXPRESSIO

3、NOFEPROTEINOFDUCKTEMBUSUVIRUSINPROKARYOTICCELLSJIXiwen12，LIXuesong1，BIANYanfeng3，LIGuoxin1，YANPixi1，ZHANGQijin2，LIZejun1（1.ShanghaiVeterinaryResearchInstituteCAASShanghai200241China2.CollegeofVeterinaryMedicineInnerMongo

4、liaAgriculturalUniversityHohhot010018China3.TianjinShengjiGroupCo.Ltd.Tianjin300384China）Abstract:TheEgeneofduckTembusuvirus(DTMUV)wasamplifiedbyRTPCRedintothemultipleclonesitesofthepET32a()vect.Therecombinantplaswastran

5、sfmedintoBL21(DE3)competentcellsthecellswereinducedwithIPTGtoexpresstheEprotein.SDSPAGEWesternBlotassaysshowedthatheEproteinwassuccessfullyexpressedkepttheactivityfbindingtheDTMUVspecificantibody.BasedonEproteinexpressed

6、inprokaryoticcellsitmightbecomeeasytodevelopdiagnosiskitsvaccinesfDTMUV.Keywds:DucktembusuvirusEgenecloningexpression自2010年春季以來，中國華東地區(qū)發(fā)生了以產(chǎn)蛋下降和死亡為主要特征的鴨病的流行，之后該病迅速傳播全國多個(gè)省市，到目前為止，全國大部分主要水禽養(yǎng)殖地區(qū)仍然受到該病的威脅，發(fā)病率高達(dá)100%，病死率在5%~10

7、%之間。經(jīng)過病毒分離鑒定，目前已經(jīng)確定引起該病的病原為鴨坦布蘇病毒（DucktembusuvirusDTMUV）[1]。DTMUV屬黃病毒科黃病毒屬[2]，呈球型，直徑30～50nm，核心含單股RNA，有衣殼。從序列上分析，該病毒可能與其他黃病毒屬的病毒一樣，具有3結(jié)構(gòu)蛋白，即E蛋白、核蛋白和白蛋白為糖蛋白。其中，E蛋白是誘發(fā)動物機(jī)體產(chǎn)生抗日本乙腦病毒中和抗體的重要抗原[3]，黃病毒屬中多數(shù)病毒的E蛋白與機(jī)體宿主的免疫應(yīng)答作用密切收稿日

8、期：20120223基金項(xiàng)目：公益性行業(yè)(農(nóng)業(yè))專項(xiàng)經(jīng)費(fèi)(201003012)；國家國際科技合作項(xiàng)目（2010DFB33920）；中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院上海獸醫(yī)研究所中央級公益性科研院所基本科研業(yè)務(wù)費(fèi)專項(xiàng)資金項(xiàng)目（2010JB04）作者簡介：姬希文，女，碩士研究生，預(yù)防獸醫(yī)學(xué)專業(yè)通信作者：李澤君，Email：lizejun@shvri.圖1鴨坦布蘇病毒鴨坦布蘇病毒E基因的基因的PCR擴(kuò)增擴(kuò)增Fig.1PCRamplifiedEgenefromD

9、TMUVM:DNA分子質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)(DL2000)1:E基因的PCR產(chǎn)物2:陰性對照M:DNAMarker(DL2000)1:PCRproductsofEgene2:Negativecontrol3討論討論鴨坦布蘇病毒(DTMUV)與西尼羅病毒（WestnilevirusWNV）、登革病毒（DenguevirusDV）同屬黃病科黃病毒屬成員，推測其E蛋白有著與其他黃病毒E蛋白有著相似的結(jié)構(gòu)和功能。Kolaskar等[79]的研究表明，E蛋白

10、含有3個(gè)抗原域：域Ⅰ，也稱為中心域，由E1位～E51位、E137位～E196位和E293位～E311位的130個(gè)氨基酸殘基組成，此域有糖基化位點(diǎn)和具有血清學(xué)及生物學(xué)活性的抗原表位；域Ⅱ，由E52位～E136位和E197位～E292位的181個(gè)氨基酸殘基組成，具有中和活性和血凝活性的抗原表位；域Ⅲ，由E312位～E411位的100個(gè)氨基酸殘基組成，參與受體結(jié)合過程，在黃病毒屬中十分保守[10]。決定毒力的基因片段主要集中在E蛋白編碼區(qū)，E

11、蛋白是病毒表面棘突的主要成分，它可激發(fā)中和抗體和保護(hù)性免疫，一般認(rèn)為它是病毒受體的結(jié)合蛋白，并介導(dǎo)膜融合和細(xì)胞穿入。本研究利用PCR技術(shù)擴(kuò)增出了DTMUV完整E蛋白基因片段[11]，含有形成高級結(jié)構(gòu)所需的所有元件。為了分析原核表達(dá)的E蛋白的生物學(xué)特性，建立安全、簡便和經(jīng)濟(jì)的制備DTMUV診斷抗原的方法，筆者構(gòu)建了DTMUVE表達(dá)載體，并在大腸桿菌中表達(dá)。由于大腸桿菌表達(dá)菌株BL21（DE3pLysS）的轉(zhuǎn)化效率相對較低，所以按pET系列

12、載體克隆操作說明的方法，先把目的基因和載體的連接產(chǎn)物克隆入大腸桿菌JM109中，篩選出重組質(zhì)粒后，再把重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化表達(dá)菌株BL21（DE3），最后成功地在大腸桿菌中表達(dá)了E蛋白。DTMUV的E蛋白在病毒與敏感細(xì)胞結(jié)合過程中起著重要的作用，DTMUV敏感細(xì)胞表面有病毒的相應(yīng)受體，但其結(jié)構(gòu)和功能尚未明確。我們用原核表達(dá)系統(tǒng)表達(dá)E蛋白，在多次嘗試不同表達(dá)載體與宿主菌之后，成功的構(gòu)建了E蛋白的原核表達(dá)載體。對原核表達(dá)產(chǎn)物的可溶性分析結(jié)果表明，表