鴨坦布蘇病毒e蛋白基因的原核表達

1、鴨坦布蘇病毒E蛋白基因的原核表達?姬希文12，李雪松1，邊延峰3，李國新1，顏丕熙1，張七斤2，李澤君1(1.中國農業(yè)科學院上海獸醫(yī)研究所，上海200241；2.內蒙古農業(yè)大學獸醫(yī)學院，呼和浩特010018；3.天津生機集團股份有限公司，天津300384）摘要：本研究利用RTPCR方法擴增鴨坦布蘇病毒（DuckTembusuvirus，DTMUV）奉賢株（FX2010）的結構蛋白E基因，并將其克隆至原核表達載體pET32a（），構建重組

2、表達質粒pET32aE。將其轉化受體菌E.coliBL21(DE3)感受態(tài)細胞，經IPTG誘導進行表達。SDSPAGE和Westernblot試驗檢測結果表明，E基因在大腸桿菌中得到了表達，并且可與抗DTMUV的多克隆抗體發(fā)生特異性反應。E基因的成功表達為DTMUV的診斷試劑盒、疫苗等的研制奠定基礎。關鍵詞：鴨坦布蘇病毒；E基因；克??；表達中圖分類號：文獻標志碼：A文章編號：16746422（2012）02000000EXPRESSIO

3、NOFEPROTEINOFDUCKTEMBUSUVIRUSINPROKARYOTICCELLSJIXiwen12，LIXuesong1，BIANYanfeng3，LIGuoxin1，YANPixi1，ZHANGQijin2，LIZejun1（1.ShanghaiVeterinaryResearchInstituteCAASShanghai200241China2.CollegeofVeterinaryMedicineInnerMongo

4、liaAgriculturalUniversityHohhot010018China3.TianjinShengjiGroupCo.Ltd.Tianjin300384China）Abstract:TheEgeneofduckTembusuvirus(DTMUV)wasamplifiedbyRTPCRedintothemultipleclonesitesofthepET32a()vect.Therecombinantplaswastran

5、sfmedintoBL21(DE3)competentcellsthecellswereinducedwithIPTGtoexpresstheEprotein.SDSPAGEWesternBlotassaysshowedthatheEproteinwassuccessfullyexpressedkepttheactivityfbindingtheDTMUVspecificantibody.BasedonEproteinexpressed

6、inprokaryoticcellsitmightbecomeeasytodevelopdiagnosiskitsvaccinesfDTMUV.Keywds:DucktembusuvirusEgenecloningexpression自2010年春季以來，中國華東地區(qū)發(fā)生了以產蛋下降和死亡為主要特征的鴨病的流行，之后該病迅速傳播全國多個省市，到目前為止，全國大部分主要水禽養(yǎng)殖地區(qū)仍然受到該病的威脅，發(fā)病率高達100%，病死率在5%~10

7、%之間。經過病毒分離鑒定，目前已經確定引起該病的病原為鴨坦布蘇病毒（DucktembusuvirusDTMUV）[1]。DTMUV屬黃病毒科黃病毒屬[2]，呈球型，直徑30～50nm，核心含單股RNA，有衣殼。從序列上分析，該病毒可能與其他黃病毒屬的病毒一樣，具有3結構蛋白，即E蛋白、核蛋白和白蛋白為糖蛋白。其中，E蛋白是誘發(fā)動物機體產生抗日本乙腦病毒中和抗體的重要抗原[3]，黃病毒屬中多數(shù)病毒的E蛋白與機體宿主的免疫應答作用密切收稿日

8、期：20120223基金項目：公益性行業(yè)(農業(yè))專項經費(201003012)；國家國際科技合作項目（2010DFB33920）；中國農業(yè)科學院上海獸醫(yī)研究所中央級公益性科研院所基本科研業(yè)務費專項資金項目（2010JB04）作者簡介：姬希文，女，碩士研究生，預防獸醫(yī)學專業(yè)通信作者：李澤君，Email：lizejun@shvri.圖1鴨坦布蘇病毒鴨坦布蘇病毒E基因的基因的PCR擴增擴增Fig.1PCRamplifiedEgenefromD

9、TMUVM:DNA分子質量標準(DL2000)1:E基因的PCR產物2:陰性對照M:DNAMarker(DL2000)1:PCRproductsofEgene2:Negativecontrol3討論討論鴨坦布蘇病毒(DTMUV)與西尼羅病毒（WestnilevirusWNV）、登革病毒（DenguevirusDV）同屬黃病科黃病毒屬成員，推測其E蛋白有著與其他黃病毒E蛋白有著相似的結構和功能。Kolaskar等[79]的研究表明，E蛋白

10、含有3個抗原域：域Ⅰ，也稱為中心域，由E1位～E51位、E137位～E196位和E293位～E311位的130個氨基酸殘基組成，此域有糖基化位點和具有血清學及生物學活性的抗原表位；域Ⅱ，由E52位～E136位和E197位～E292位的181個氨基酸殘基組成，具有中和活性和血凝活性的抗原表位；域Ⅲ，由E312位～E411位的100個氨基酸殘基組成，參與受體結合過程，在黃病毒屬中十分保守[10]。決定毒力的基因片段主要集中在E蛋白編碼區(qū)，E

11、蛋白是病毒表面棘突的主要成分，它可激發(fā)中和抗體和保護性免疫，一般認為它是病毒受體的結合蛋白，并介導膜融合和細胞穿入。本研究利用PCR技術擴增出了DTMUV完整E蛋白基因片段[11]，含有形成高級結構所需的所有元件。為了分析原核表達的E蛋白的生物學特性，建立安全、簡便和經濟的制備DTMUV診斷抗原的方法，筆者構建了DTMUVE表達載體，并在大腸桿菌中表達。由于大腸桿菌表達菌株BL21（DE3pLysS）的轉化效率相對較低，所以按pET系列

12、載體克隆操作說明的方法，先把目的基因和載體的連接產物克隆入大腸桿菌JM109中，篩選出重組質粒后，再把重組質粒轉化表達菌株BL21（DE3），最后成功地在大腸桿菌中表達了E蛋白。DTMUV的E蛋白在病毒與敏感細胞結合過程中起著重要的作用，DTMUV敏感細胞表面有病毒的相應受體，但其結構和功能尚未明確。我們用原核表達系統(tǒng)表達E蛋白，在多次嘗試不同表達載體與宿主菌之后，成功的構建了E蛋白的原核表達載體。對原核表達產物的可溶性分析結果表明，表