廣西鴨坦布蘇病毒分離鑒定、全序列分析與間接ELISA方法的建立.pdf

1、鴨坦布蘇病毒病是近年影響我國養(yǎng)鴨業(yè)的主要疫病之一，引起該病的病原為鴨坦布蘇病毒(Duck Tembusu Virus，DTMUV)。該病主要引起種鴨和蛋鴨產(chǎn)蛋量大幅下降甚至停產(chǎn)，給我國養(yǎng)鴨業(yè)造成了重大經(jīng)濟(jì)損失。本研究開展了近年該病在廣西發(fā)生的臨床病例的診斷及其病原的相關(guān)研究。具體研究內(nèi)容和結(jié)果如下:
　　一、DTMUV的分離鑒定、全基因組測定和遺傳變異分析
　　本研究對2012-2015年廣西地區(qū)疑似發(fā)生DTMUV感染的臨床

2、病例進(jìn)行RT-PCR快速診斷，并對陽性臨床樣品進(jìn)行病毒分離鑒定，成功分離到四株DTMUV，分別命名為GX120915、GX130330、GX150829、GX151002。對4個DTMUV分離株用BHK-21細(xì)胞進(jìn)行噬斑純化，獲得四株含單一病毒的DTMUV。將純化的分離株進(jìn)行全基因組序列測定、遺傳變異分析、分子生物學(xué)特性研究、毒力測定以及動物回歸試驗(yàn)。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，GX120915、GX130330、GX150829、GX151002的基因

3、組全長分別為10991bp、10991bp、10990bp、10992bp，僅含一個大的閱讀框，編碼3425個氨基酸的多聚蛋白，兩側(cè)各有一個非編碼區(qū)。與NCBI公布的51株TMUV核苷酸同源性高于96％，氨基酸的同源性高于98％。GX150829分離株與其他地區(qū)分離株親緣關(guān)系更近，屬同一分支;GX120915、GX130330、GX151002與廣西分離株GX2013G、GX2013H和重慶分離株CQW1的親緣關(guān)系最近，形成了一個小分支

4、，具有地方特色，這與E基因、NS5基因構(gòu)建的遺傳進(jìn)化樹結(jié)構(gòu)相一致。分離株均無血凝活性。分離株的鴨胚半數(shù)致死量(ELD50)為10-4.32～10-4.68/0.2mL。動物回歸試驗(yàn)結(jié)果表明，GX120915、GX130330、GX10829、GX151002對7天齡靖西麻鴨有較強(qiáng)的致病力，發(fā)病率為60％～80％，死亡率為20％～40％，四株分離株人工感染靖西麻鴨的臨床發(fā)病特征與自然感染病例相似。
　　二、DTMUV E蛋白主要抗原

5、區(qū)域的原核表達(dá)與鑒定
　　根據(jù)GX120915株結(jié)構(gòu)蛋白E基因序列，設(shè)計合成一對特異性引物，RT-PCR擴(kuò)增1194 bp E基因片段克隆至pMD18-T載體中，測序及酶切鑒定正確后，將目的基因定向克隆至pET-32a表達(dá)載體中，測序及酶切鑒定正確后，轉(zhuǎn)化大腸桿菌BL21，經(jīng)IPTG誘導(dǎo)獲得目的蛋白，同時利用鎳離子親和層析柱對目的蛋白進(jìn)行純化，不同濃度尿素進(jìn)行復(fù)性，SDS-PAGE電泳和Western blot結(jié)果顯示目的蛋白大小

6、約為53 kDa，與預(yù)期一致，表明目的蛋白得到表達(dá)，且具有良好的免疫原性。
　　三、DTMUV E蛋白間接ELISA方法的建立
　　將表達(dá)具有良好免疫原性的E蛋白作為包被抗原，建立檢測DTMUV抗體的間接ELISA方法，經(jīng)過優(yōu)化條件后，確定判定陰陽性的臨界值為0.354。用建立的ELISA方法檢測常見鴨源病毒病的陽性血清，檢測結(jié)果均低于臨界值，表明其特異性強(qiáng);批內(nèi)和批間重復(fù)試驗(yàn)的平均變異系數(shù)都小于10％，說明其穩(wěn)定性好;敏感