蘋果蠹蛾嗅覺蛋白的鑒定與組織分布研究.pdf

1、蘋果蠹蛾Cydia pomonella(L.)是世界范圍分布的重要果樹害蟲，以幼蟲鉆蛀果實為害，造成蘋果、梨等水果的商品價值降低甚至喪失經(jīng)濟(jì)價值。蘋果蠹蛾成蟲具有發(fā)達(dá)的嗅覺系統(tǒng)，能夠感知雌蟲釋放的性信息素和種類繁多的寄主植物揮發(fā)物。利用蘋果蠹蛾的嗅覺，通過人工合成的性信息素和植物揮發(fā)物治理蘋果蠹蛾高效且安全，取得了很好的經(jīng)濟(jì)效益和社會效益。
　　昆蟲嗅覺包括發(fā)生在嗅覺感器中的外圍嗅覺活動和中樞神經(jīng)層面的嗅覺信號處理。氣味結(jié)合蛋白(

2、OBPs)、化學(xué)感受蛋白(CSPs)、氣味降解酶(ODEs)、感覺神經(jīng)元膜蛋白(SNMPs)和氣味受體(ORs)分布于嗅覺感器，參與了將氣味分子攜帶的化學(xué)信號轉(zhuǎn)換為嗅覺電位信號的生理過程，是昆蟲外圍嗅覺活動的分子基礎(chǔ)。本研究通過分析蘋果蠹蛾成蟲轉(zhuǎn)錄組，鑒定得到47個候選的嗅覺蛋白。其中2個OBPs、1個CSPs、2個SNMPs和30個候選ODEs在蘋果蠹蛾成蟲觸角中表達(dá)。結(jié)合已報道的蘋果蠹蛾ORs，初步描述了蘋果蠹蛾外圍嗅覺活動的生化進(jìn)

3、程:進(jìn)入嗅覺感器的氣味分子由CpomOBPs和CpomCSPs結(jié)合并轉(zhuǎn)運(yùn)穿過感器血淋巴到達(dá)嗅覺神經(jīng)元;氣味分子被CpomORs識別并產(chǎn)生嗅覺電位信號(性信息素的識別還需要CpomSNMPs協(xié)助);最后，失去時效性的氣味分子被蘋果蠹蛾ODEs降解。主要研究成果如下:
　　1.在蘋果蠹蛾中鑒定得到2個OBPs和3個CSPs。其中CpomOBP13、CpomOBP14和CpomCSP13在蘋果蠹蛾成蟲觸角中分布。CpomOBP13氨基酸

4、序列包含6個保守的半胱氨酸殘基，氮端起始的19個氨基酸殘基形成一段信號肽序列，屬于傳統(tǒng)OBPs(Classic OBPs);CpomOBP14也包含一段信號肽序列，除了包含與CpomOBP13同源的6個保守半胱氨酸殘基之外，還包含6個碳端的保守半胱氨酸殘基，屬于Plus-C OBPs。CpomCSP13、CpomCSP14和CpomCSP15均包含信號肽序列和4個保守的半胱氨酸殘基。在觸角中表達(dá)的CpomOBP13、CpomOBP14和

5、CpomCSP13與其他鱗翅目嗅覺功能OBPs和CSPs親緣關(guān)系較近。信號肽的存在說明它們屬于分泌型蛋白，分布于血淋巴中;保守的半胱氨酸與二硫鍵的形成有關(guān)，對蛋白形成特定空間結(jié)構(gòu)有重要作用。
　　2.克隆得到2個蘋果蠹蛾SNMPs。CpomSNMP1和CpomSNMP2屬于跨膜蛋白，含有兩個跨膜區(qū)域和一個細(xì)胞外環(huán)結(jié)構(gòu)，胞外環(huán)結(jié)構(gòu)中的6個保守半胱氨酸參與了二硫鍵的形成。系統(tǒng)發(fā)育分析表明，昆蟲SNMPs分為SNMP1和SNMP2兩個亞

6、族，CpomSNMP1和CpomSNMP2分別位于鱗翅目昆蟲的SNMP1和SNMP2所在分支。組織分布上，CpomSNMP1僅在蘋果蠹蛾成蟲觸角中表達(dá)，且在雄蟲觸角中的表達(dá)量高于雌蟲，CpomSNMP2也是觸角特異性蛋白，但在雌、雄蟲觸角中的表達(dá)水平相當(dāng)。我們制備了CpomSNMP2多克隆抗體用于研究CpomSNMP2在蘋果蠹蛾觸角上的組織分布情況，CpomSNMP2定位于蘋果蠹蛾的毛形感器和刺形感器。說明CpomSNMP2與蘋果蠹蛾嗅

7、覺功能緊密相關(guān)。
　　3.鑒定得到的蘋果蠹蛾生物轉(zhuǎn)化酶中，12個羧酸酯酶(CXEs)、2個醛氧化酶(AOXs)和6個醇脫氫酶(ADs)在觸角中分布。CpomCXEs包含保守的催化三分子“Ser-His-Glu”和催化活性中心“Gly Xxx Ser Xxx Gly”;CpomAOXs具有兩個鐵硫氧化還原中心、一個FAD結(jié)合區(qū)域和一個鉬離子/底物結(jié)合區(qū)域;CpomADs來自不同的蛋白家族，包括短鏈脫氫酶、中鏈脫氫酶和醛酮還原酶，分別

8、包含各自蛋白家族的催化活性位點和輔酶結(jié)合位點。系統(tǒng)發(fā)育分析表明，這些觸角生物轉(zhuǎn)化酶與其他昆蟲的ODEs或抗性相關(guān)酶親緣關(guān)系近。蘋果蠹蛾能夠感知脂類、醇類、醛類等各種揮發(fā)性氣味分子，在觸角中分布的CXEs、AOXs和ADs可能參與了氣味分子的降解。
　　4.GSTs是昆蟲體內(nèi)重要的多功能生物轉(zhuǎn)化酶。鑒定得到的蘋果蠹蛾谷胱甘肽S-轉(zhuǎn)移酶(GSTs)包括12個胞質(zhì)GSTs和2個微粒體GSTs。每個胞質(zhì)GSTs均包含一個保守的氮端還原型谷

9、胱甘肽(GSH)結(jié)合區(qū)域和一個高度變異的碳端底物結(jié)合區(qū)域;而微粒體GSTs具有3個跨膜區(qū)域和一個由16個氨基酸殘基組成的保守主題序列。8個蘋果蠹蛾胞質(zhì)GSTs和2個微粒體GSTs在成蟲觸角中分布;其中在觸角上特異性表達(dá)的CpomGSTd2是具有信號肽序列的特殊GSTs;這些在蘋果蠹蛾觸角中表達(dá)的GSTs，尤其是CpomGSTd2，可能參與了嗅覺信號的終止。進(jìn)一步的活性檢測實驗表明，CpomGSTd2重組蛋白在25-50℃的溫度范圍內(nèi)具有