人不成熟樹突狀細胞體外擴增及低溫凍存的研究.pdf

1、在大面積深度燒傷患者的救治工作中，及時有效的創(chuàng)面覆蓋是治療的關鍵。同種異體皮膚移植為創(chuàng)面覆蓋提供了良好的思路。但目前臨床上移植后的排斥反應嚴重影響了治療效果。免疫抑制劑可以延長異體皮的存活時間，但大劑量抗排斥藥物的應用同時增加了患者感染的危險性。通過攜帶供者抗原的不成熟樹突狀細胞誘導異基因皮膚移植耐受為延長異體皮成活時間的有效途徑。 樹突狀細胞(dendriticcell，DC)是體內(nèi)功能最強的抗原遞呈細胞(antigen-pr

2、esentingcell，APC)，是天然免疫和獲得性免疫的重要調(diào)節(jié)劑。在樹突狀細胞的發(fā)育過程中，不成熟樹突狀細胞(immaturedendriticcell，imDC)與成熟DC(maturedendriticcell，mDC)在表型特征以及生物學功能上都有區(qū)別。imDC由于其細胞表面缺乏MHC-Ⅱ類分子和共刺激分子，在免疫應答過程中非但不能激活T細胞，反而能誘導抗原特異性T細胞無能或凋亡，在誘導抗原特異性免疫耐受中發(fā)揮了重要作用。i

3、mDC穩(wěn)定性差，在正常培養(yǎng)條件下難以長期保存，臨床上使用的異體皮都來自死后捐贈者，同時燒傷發(fā)生具有極大的偶然性，如何長期有效的保存攜帶供者抗原的不成熟樹突狀細胞并保持其不成熟特性成為問題的關鍵。本實驗研究臍血來源的不成熟樹突狀細胞低溫凍存前后所表現(xiàn)的生物特性，為不成熟樹突狀細胞的臨床應用提供保存方法。 在本研究中，我們?nèi)⌒迈r臍血分離單個核細胞，在體外經(jīng)粒系—巨噬細胞系集落刺激因子(GM-CSF)和白介素4(IL-4)誘導產(chǎn)生不成

4、熟樹突狀細胞，加10％二甲基亞砜(dimethylsulfoxide，DMSO)/5％二甲基亞砜(DMSO)+6％羥乙基淀粉(hydroxyethylstarch，HES)作為保護劑，-80℃冰箱降溫，-196℃保存，35～40℃水浴復溫，獲得凍存不成熟樹突狀細胞。光鏡下觀察臺盼藍拒染回收率；電鏡下觀察細胞形態(tài)；流式細胞儀檢測兩組細胞表面成熟標志(CD80、CD83和CD86)；混合淋巴細胞反應(mixedlymphocytereact

5、ion，MLR)檢測兩組細胞刺激未致敏T淋巴細胞增殖能力。 主要結(jié)果： 1.培養(yǎng)細胞體積增大，表面可見毛刺樣不規(guī)則突起，電鏡下細胞形態(tài)不規(guī)則，表面粗糙，明顯可見突起及皺襞；細胞表型具有典型的DC特征(CD1a、CD14、CD80、CD83、CD86、HLA-DR的表達率分別為62.49％，18.28％，12.46％，4.60％，11.51％，67.4％)；混合淋巴細胞反應(MLR)中細胞不能刺激同種未致敏T淋巴細胞增殖。

6、 2.應用高濃度DMSO作保護劑的凍存不成熟樹突狀細胞和應用低濃度DMSO的細胞，臺盼藍拒染回收率(trypanbluerecoveryrate，TBRR)均大于85％，其細胞形態(tài)、成熟相關表型抗原(CD80、CD83和CD86)并未發(fā)生明顯改變；不能刺激同種未致敏T淋巴細胞增殖的能力與新鮮不成熟樹突狀細胞無顯著性差異。 主要結(jié)論： 1.本實驗獲得的不成熟樹突狀細胞細胞具有典型的DC形態(tài)，在細胞表型和細胞功能試驗