人外周血樹突狀細胞體外無血清誘導擴增的研究.pdf

1、目的：樹突狀細胞(dendritic cell，DC)是目前發(fā)現(xiàn)的功能最強大的專職抗原提呈細胞(antigen presenting cells，APC)，能攝取提呈抗原，強烈刺激初始型T細胞(naive T cell)增殖，促進細胞毒性T細胞(CTL)和T輔助細胞的生成，誘導高效特異的細胞免疫和體液免疫反應，是免疫反應的啟動因子和調(diào)節(jié)因子。基于DC強大抗原提呈功能的主動特異性免疫治療已逐漸成為腫瘤免疫治療研究的主要方向。雖然DC在體內(nèi)

2、分布廣泛，但數(shù)量少且分散，而未成熟DC主要分布在外周非淋巴組織內(nèi)，直接分離、提純十分困難，不能滿足體內(nèi)或體外研究及臨床應用的需要。如何在體外大量擴增DC一直是DC研究的熱點。目前大多數(shù)體外誘導DC的研究都使用了有血清培養(yǎng)基，但由于添加胎牛血清存在安全性低，不宜質(zhì)控等缺點，無血清培養(yǎng)基正得到越來越廣泛的應用，無血清培養(yǎng)基的使用也是DC療法應用于臨床的前提。本研究的目的是建立可用于臨床治療功能成熟的DC體外無血清擴增的優(yōu)化培養(yǎng)方案，并比較無

3、血清、替代血清和動物血清之間培養(yǎng)DC的效率。 方法：本研究通過采用X-VIVO20無血清培養(yǎng)基聯(lián)合細胞因子rhGM-CSF(100ng/ml)和rhIL-4(50ng/ml)擴增人外周血分離的單個核細胞，細胞培養(yǎng)分別按5×10<'6>/ml、6×10<'6>/ml和7×10<'6>/ml的密度，加入6孔培養(yǎng)板(2ml/孔)。第6d加入：rhTNF-a(100ng/ml)聯(lián)合培養(yǎng)，分別于第6d，第9d和12d收獲細胞。從形態(tài)學、細

4、胞表面標志以及混合淋巴細胞反應(MLR)中對同種異體未致敏T淋巴細胞刺激能力等三個方面進行鑒定。我們對DC體外誘導擴增的無血清條件下的細胞培養(yǎng)密度和培養(yǎng)時間進行了探索和優(yōu)化。并比較無血清培養(yǎng)，替代血清培養(yǎng)和動物血清培養(yǎng)DC之間的效率差異。本研究分兩部分進行：1、無血清培養(yǎng)基對人外周血來源DC的體外擴增和鑒定。2、無血清培養(yǎng)，替代血清培養(yǎng)和動物血清培養(yǎng)DC的效率比較。 結(jié)果： 1、形態(tài)學觀察：倒置顯微鏡觀察，經(jīng)過9 d誘導

5、后，培養(yǎng)細胞懸浮生長，體積較前增大，可見有胞體拉長、表面可見毛刺狀突起具有典型樹突細胞外形。 2、細胞表面標記分析：流式細胞儀分析，6×10<'6>/ml密度的細胞培養(yǎng)組培養(yǎng)到第9天最宜。培養(yǎng)細胞其表面共刺激分子CDla的表達率為36.57﹪+0.92﹪。 3、MLR中，培養(yǎng)Dc能刺激同種異體未致敏T淋巴細胞的增殖。 4、無血清培養(yǎng)，替代血清培養(yǎng)和動物血清培養(yǎng)DC的效率之間存在統(tǒng)計學差異(P值<0.05)。其中動

6、物血清培養(yǎng)組，獲得65.00﹪+5.27﹪CDla細胞；替代血清培養(yǎng)組，獲得47.33﹪+5.46﹪CDla細胞；無血清培養(yǎng)組，能夠獲得36.57﹪+0.92﹪CDla細胞。 結(jié)論： 1、培養(yǎng)細胞具有典型的DC的形態(tài)特征，細胞表型及功能實驗證實其DC的特性，說明本實驗建立的無血清培養(yǎng)基聯(lián)合細胞因子rhGM-CSF、rhIL-4和rhTNF-a體外誘導DC的方法是切實可行的。 2、無血清培養(yǎng)，替代血清培養(yǎng)和動物血清培養(yǎng)DC