全新VEGF受體抑制劑的設計與合成研究.pdf

1、惡性腫瘤是當前嚴重影響人類健康、威脅人類生命的主要疾病之一,世界衛(wèi)生組織和各國政府衛(wèi)生部門都把攻克癌癥列為一項首要任務。目前,臨床上常用的抗癌藥物主要是細胞毒類藥物,這類藥物因其細胞毒的固有性質而具有難以避免的選擇性差、毒副作用強、易產(chǎn)生耐藥性等缺點。因此,尋找特異性高、毒性小、病人耐受性好的新靶標就成為抗癌藥物研究的迫切需要。近年來,隨著生命科學研究的飛速發(fā)展,眾多基于癌細胞發(fā)生、發(fā)展機制的特異性靶點被鑒定出來,如：參與胞內信號轉導的

2、蛋白酪氨酸激酶(PTK)、蛋白激酶C(PKC)、法尼基轉移酶(Ftase),參與細胞周期調節(jié)的細胞周期蛋白依賴性激酶(CDK),誘導腫瘤細胞調亡的Bcl-2蛋白,抑制腫瘤血管生成的血管內皮細胞生長因子(VEGF),參與胞外基質降解和重建的基質金屬蛋白酶(MMP)等。尋找選擇性作用于這些特異性靶點的高效、低毒、專屬性強的新型抗癌藥物已成為當今抗腫瘤藥物研究的主要方向。 血管生成(angiogenesis)是指從已存在的血管上發(fā)育出

3、新的血管系統(tǒng)。正常的血管生成只在某些短期、特定的生理過程中存在,如生殖、傷口愈合等。而異常的血管生成則是腫瘤、風濕性關節(jié)炎、糖尿病性視網(wǎng)膜病變等惡性疾病的病理表現(xiàn)之一。自從Folkman(1933-2008)提出血管生成與腫瘤的發(fā)生發(fā)展密切相關的假說以來,大量的臨床實踐與實驗研究證實了抑制腫瘤介導的血管生成可以有效地抑制腫瘤的生長和轉移。今天,已有10個抑制血管生成的抗癌藥物上市,全球有超過120萬人接受抗血管生成治療。 VEG

4、F受體是抗血管生成的重要靶標。近年來,靶向VEGF受體的小分子抑制劑的研究非?；钴S,大量結構各異的抑制劑被報道出來,具代表性的有2-吲哚酮類,4-苯胺基喹唑啉類和2,4-二氮雜萘類等。其中一些化合物已分別進入各期臨床評價,顯示出良好的應用前景。但目前這些抑制劑仍存在一些問題,例如它們都是ATP的競爭性抑制劑,而細胞內尤其是癌細胞內的ATP濃度能達到5mmol/L以上,因此抑制劑活性應至少達到納摩爾級水平才能表現(xiàn)出有效的抑制作用。另外,V

5、EGF受體屬于酪氨酸激酶超家族,該家族成員廣泛參與體內生物信號的傳導。由于序列的同源性,它們的ATP結合位點的三維結構是高度保守的。因此如何提高抑制劑在這些家族成員中的選擇性也是一個研究重點。所以,尋找高活性,高選擇性的VEGF受體抑制劑仍是今后的研究方向。隨著計算機輔助藥物設計技術的廣泛應用,VEGF受體的結構和功能以及與抑制劑的作用機制的逐漸闡明,VEGF受體抑制劑的開發(fā)正由隨機篩選轉為合理藥物設計(SBDD)。 本課題旨在

6、應用計算機輔助藥物設計技術和化學合成手段,在全面探測VEGF受體活性腔的性質、深入探討受體與抑制劑的作用模式的基礎上,設計、合成新型的VEGF受體抑制劑先導化合物,為發(fā)現(xiàn)新型高效、低毒的抗癌藥物打下堅實的基礎。為此,我們主要進行了以下幾方面的工作： 一、VEGFR-2活性腔性質的研究 活性腔的性質以及與配體結合相關的關鍵殘基是基于結構合理藥物設計的基礎,但目前仍沒有對VEGFR-2活性腔進行全面深入分析的報道。為此,我們

7、首先運用活性位點搜尋工具(Binding Site Analysis)確定了VEGFR-2活性腔的形狀與大小,然后采用多拷貝同時搜尋法(MCSS)對VEGFR-2活性腔進行分析,計算結果顯示活性腔可分為3個疏水性區(qū)域和1個極性區(qū)域:I區(qū)為與絞鏈區(qū)毗鄰的一個扁平的,由Val846,Ala864,Val897,Val914,Phe916,Leu1033的疏水性側鏈組成的疏水腔。II區(qū)是由Ile886,Leu887,Ile890,Val896

8、,Val897,Leu1017,Ile1042,Phe1047的疏水性側鏈組成的1個較大的疏水腔。位于I區(qū)和II區(qū)之間的由Lys866,Glu883的極性側鏈和Asp1044的骨架羰基氧組成環(huán)狀極性區(qū)域對于配體的結合也很重要。Ⅲ位于活性腔開口向溶劑的位置,是由Leu838和Phe916的側鏈組成的小的疏水性區(qū)域。IV區(qū)是由Asn921,Leu1033,Cys1043的疏水性殘基和Arg1030,Asn1031的親水性殘基組成的一個極性區(qū)

9、域。其中Arg1030側鏈上的N-H也是關鍵的氫鍵供體位點。這些結果與眾多文獻報道的抑制劑與VEGFR-2的結合模式一致。 為了考察VEGFR-2活性腔在與配體結合前和結合后的構象差異,即受體與配體的誘導契合作用,我們對已公布的VEGFR-2游離態(tài)晶體結構和8個復合物晶體結構進行了全面的比較。將這9個晶體結構活性腔范圍內的肽鏈的Cα原子進行疊合,計算其RMSD值,比較它們之間的異同。結果發(fā)現(xiàn)活性腔內I區(qū)、Ⅲ區(qū)和IV區(qū)內的肽鏈骨架

10、以及殘基側鏈的變化均較小,而II區(qū)內活化環(huán)的起始端DFG序列的構象有顯著的差異,其中Phe1047側鏈的空間取向在不同的復合物中也完全不同。這些構象變化改變了II區(qū)的形狀和大小,這提示我們在模擬VEGFR-2與抑制劑的結合模式時考慮II區(qū)的柔性變化對獲得準確的結果是非常重要的。 二、VEGFR-2與抑制劑結合模式的分子模擬 研究不同類型抑制劑與靶酶的結合方式對于深刻理解受體-配體相互作用制可以提供豐富的信息,而目前文獻對

11、此的報道卻是分散的和不全面的。因此我們采用柔性分子對接技術對已報道的各類VEGFR-2抑制劑與VEGFR-2活性腔進行對接研究,考察它們與受體結合特點的異同,確定參與配體結合的關鍵殘基及其空間取向。結果發(fā)現(xiàn):I區(qū)中有2個關鍵的氫鍵作用位點:Glu917骨架上的C=O作為氫鍵受體,Cys919骨架上的N-H作為氫鍵供體,絕大部分抑制劑都與這一個或兩個氫鍵位點發(fā)生相互作用。Lys868、Glu885和Asp1046形成的極性區(qū)域對提高配體親

12、合力很重要,疏水腔Ⅲ和極性腔IV是額外增強配體結合力的區(qū)域,IV區(qū)的Asn923可提供額外的氫鍵作用位點。在此基礎上,我們采用LIQUID程序建立了VEGFR-2受體的三維藥效團模型,它包含與受體結合關鍵的10個藥效點。藥效團模型直觀地反映了各關鍵的藥效點的空間分布以及彼此之間的關系,可為新抑制劑的設計提供參考和思路。 三、全新VEGFR-2抑制劑的設計 根據(jù)以上研究結果,我們將已報道的抑制劑拆分成小分子片段,用LUDI

13、搜尋各個小片段在活性腔中相應區(qū)域內最佳的結合構象和空間取向,再分別連接這些最佳取向的小片段生成配體分子,再用柔性分子對接軟件Affinity評價這些新生成的分子與活性腔的親合力,最后用人工撿視揀選合成可行的目標化合物。最終,我們揀選出兩類分子3,4-二氫異喹啉類和1-異喹啉酮類進行有機合成。 四、新型VEGFR-2抑制劑的合成與活性研究 在本節(jié)中,我們共合成了24個異喹啉類化合物,除化合物22,23外,其它目標化合物均為

14、首次報道,所有目標化合物均經(jīng)1HNMR、質譜、紅外結構確定。3,4-二氫異喹啉類的通用合成方法是：3,4,5-三甲氧基苯甲醛與硝酸甲烷縮合成硝基苯乙烯,然后用LiAlH4還原成3,4,5-三甲氧基苯乙胺,再跟各種取代的苯甲酰氯制成酰氨,再經(jīng)Bischler-Napieralski環(huán)合制得目標產(chǎn)物,總收率33％。產(chǎn)物還可進一步經(jīng)鈀碳脫氫制成芳構的異喹啉或用NaBH4還原成1,2,3,4-四氫異喹啉。1-異喹啉酮類的通用合成方法是：高鄰苯二

15、甲酸與氨水制成銨鹽,高溫脫水制得高鄰苯二酰亞胺,然后與各種取代的苯甲醛經(jīng)Knoevenagel縮合、NaBH4還原、稀鹽酸水解制得目標產(chǎn)物,總收率9％。 采用了人臍靜脈內皮細胞抑制實驗和雞胚尿囊膜實驗考察了目標化合物的抗血管生成活性。人臍靜脈內皮細胞抑制實驗結果表明：本類異喹啉類化合物具有一定的的抑制血管內皮細胞增殖的活性。其中活性最強的化合物6的IC50達到了3.14μmol/L。雞胚尿囊膜實驗表明目標化合物具有不同程度的抑制