改良缺血修飾性白蛋白測(cè)定法的建立及評(píng)價(jià).pdf

1、目的:
　　 急性冠脈綜合征(acute coronary sydrome,ACS)是指不穩(wěn)定的冠脈斑塊發(fā)生破裂或表面出現(xiàn)糜爛,繼發(fā)血栓形成,血管痙攣而引起的一系列急性嚴(yán)重的心肌缺血事件,其臨床表現(xiàn)為不穩(wěn)定型心絞痛(unstable angina,UA),ST段抬高型心肌梗死(ST-elevated myocardial infarction,STENff)和非ST段抬高型心肌梗死(non-ST elevated myocard

2、ial infarction,NSTEMI)。其中急性心肌梗死(acutemyocardial infarction,AMI)發(fā)病急,死亡率高,如能在AMI早期發(fā)現(xiàn)和治療,能大大提高搶救的成功率,降低AMI的死亡率。對(duì)急性胸痛發(fā)作的患者進(jìn)行早期正確的診斷一直是急診醫(yī)生特別關(guān)注的問(wèn)題。
　　 缺血修飾性白蛋白(ischemia-modifled albumin,IMA)是近年來(lái)發(fā)現(xiàn)的一種新的生化標(biāo)志物,是美國(guó)食品和藥物管理局(Fo

3、od and Drug Administration,FDA)第一個(gè)認(rèn)可的檢測(cè)心肌缺血的生化標(biāo)志物,其具有敏感性高、陰性預(yù)測(cè)值高、出現(xiàn)時(shí)間早等特點(diǎn),它在心肌細(xì)胞壞死前的心肌缺血早期就能檢測(cè)到,在早期診斷AMI具有非常重要的意義。但缺血修飾白蛋白檢測(cè)方法比較單一,沒(méi)有統(tǒng)一的標(biāo)準(zhǔn)品,限制了其在臨床的廣泛應(yīng)用。本課題擬采用改良缺血修飾性白蛋白測(cè)定法并應(yīng)用于AMI的早期診斷,采用了以1-亞硝基-2-萘酚(1-Nitroso-2-naphthol

4、,NN)代替二硫蘇糖醇(Dithiothreitol,DTT)作為顯色劑,建立了改良缺血修飾性白蛋白測(cè)定法,并進(jìn)行方法學(xué)評(píng)價(jià)和臨床應(yīng)用評(píng)價(jià)。為AMI的早期診斷、危險(xiǎn)度分層和預(yù)后判斷提供依據(jù),達(dá)到改善病人預(yù)后和減少死亡率的目的。
　　 方法:
　　 1、改良IMA測(cè)定法的建立
　　 IMA檢測(cè)是采用白蛋白.鈷結(jié)合試驗(yàn),改良ACB試驗(yàn)以NN代替DTT作為顯色劑,確定基本反應(yīng)條件,包括①確定最大吸收波長(zhǎng):從340nm至

5、800nm做波長(zhǎng)掃描,測(cè)其吸光度,選吸光度波峰點(diǎn)作為最大吸收波長(zhǎng)。②確定最佳反應(yīng)時(shí)間:在30min內(nèi)每隔1min測(cè)定一次,每管測(cè)定2次,取吸光度均值作反應(yīng)時(shí)間曲線。③鈷離子濃度范圍的確定:用2.0g/L COCl2溶液作系列稀釋作為試劑1(R1),0.1g/L NN溶液為試劑2(R2),用722分光度計(jì)于最大吸收波長(zhǎng)處測(cè)定,作吸光度曲線。④INN濃度范圍的確定:取R1為0.05g/L COCl23ml,然后依次加入R2為不同量的0.1g

6、/L NN溶液,測(cè)定吸光度作系列NN濃度曲線。⑤標(biāo)本濃度范圍的確定:R1:0.05g/L COCl2,依次加入不同量混合血清反應(yīng)5分鐘再加入R2:0.05g/L NN,以吸光度值作標(biāo)本濃度曲線。⑥試劑穩(wěn)定性試驗(yàn):先批內(nèi)連續(xù)測(cè)定混合標(biāo)本30次,計(jì)算出均值和標(biāo)準(zhǔn)差,再將試劑放置于4℃冰箱內(nèi),然后每天連續(xù)測(cè)定同一混合血清標(biāo)本,再計(jì)算其差異,根據(jù)以(x)±3s為標(biāo)準(zhǔn)判斷是否失效。⑦抗凝劑的影響:采用肝素、3.2％枸櫞酸鈉和EDTA-K2等抗凝劑

7、,與促凝劑作對(duì)比,每種抗凝劑各取10例標(biāo)本,比較各抗凝劑對(duì)本試驗(yàn)的影響。
　　 2、改良IMA測(cè)定法的方法學(xué)評(píng)價(jià)
　　 依照美國(guó)臨床和實(shí)驗(yàn)標(biāo)準(zhǔn)化協(xié)會(huì)(CLSI)評(píng)價(jià)方案對(duì)改良IMA測(cè)定法進(jìn)行方法學(xué)評(píng)價(jià)。①精密度評(píng)價(jià):包括批內(nèi)、批間、天間和總不精密度,主要按照CLSI頒布的EP5-A2文件《定量測(cè)量方法的精密度性能評(píng)價(jià)--批準(zhǔn)指南第二版》。實(shí)驗(yàn)方法是:選取1個(gè)混合血清標(biāo)本,分裝成20份,于-20℃冰箱保存。每天測(cè)定2批,每

8、批測(cè)定2次,共進(jìn)行20天。②正確度評(píng)價(jià):主要根據(jù)CLSI頒布的EP9-A2文件即《用患者標(biāo)本進(jìn)行方法學(xué)比對(duì)及偏倚評(píng)估--批準(zhǔn)指南第二版》。該方案每天檢測(cè)8個(gè)標(biāo)本,共進(jìn)行5天,對(duì)在兩種方法間檢測(cè)得到的數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)處理,分析方法間的偏倚是否可接受。③干擾試驗(yàn):干擾試驗(yàn)根據(jù)CLSI評(píng)價(jià)方案EP7-A2,即《臨床化學(xué)干擾試驗(yàn)批準(zhǔn)指南--第二版》,采用“配對(duì)差異”的實(shí)驗(yàn)方法。選擇混合血清1份,平均分成2份,一份加入系列濃度的干擾物為臨床標(biāo)本可能

9、出現(xiàn)的最高含量,本實(shí)驗(yàn)為甘油三酯、膽紅素、血紅蛋白,另一份不加。將每份標(biāo)本重復(fù)測(cè)定10次,用各組的均值減去未加干擾物相應(yīng)組的均值即可得出干擾值。以對(duì)照該組濃度(x)±1.96s可判斷有無(wú)干擾；④線性評(píng)價(jià):根據(jù)CLSI文件EP6-A,即《定量測(cè)量方法的線性評(píng)價(jià):統(tǒng)計(jì)學(xué)方法--批準(zhǔn)指南》。設(shè)5個(gè)不同濃度的標(biāo)本,選擇高值和低值標(biāo)本各一個(gè),高值標(biāo)本為1號(hào),低值標(biāo)本為5號(hào),二者3:1混勻?yàn)?號(hào),等份混勻?yàn)?號(hào),1:3混勻?yàn)?號(hào),測(cè)定光度值并進(jìn)行曲

10、線估計(jì)；⑤分析靈敏度驗(yàn)證實(shí)驗(yàn):包括空白限(LoB)、檢出限(LoD)和定量檢出限(LoQ)。根據(jù)CLSI頒布的EP17-A文件即《檢出限和定量檢出限確定方案--批準(zhǔn)指南》。⑥鈷離子敏感度對(duì)比試驗(yàn):先用2.0g/LCoCl2溶液作15次倍比稀釋,分別加入兩種顯色劑后測(cè)定其吸光度,作吸光度曲線比較兩種顯色劑的靈敏度。
　　 3、改良IMA測(cè)定法在早期診斷AMI的應(yīng)用
　　 隨機(jī)納入臨床急診連續(xù)就診的急性胸痛癥狀患者組成待研究

11、人群,根據(jù)WHO診斷標(biāo)準(zhǔn)將研究對(duì)象分為AMI確診患者和AMI疑似患者。繪制IMA在急性胸痛患者中用于診斷AMI的受試者特征曲線(receiver operating characteristiccurvg,ROC curve),并計(jì)算曲線下面積(area under the gurve,AUC)。通過(guò)ROC曲線以及陽(yáng)性似然比取最大值的原則確定IMA早期診斷AMI的cut-off值。
　　 結(jié)果:
　　 1、改良IMA測(cè)定

12、法的建立
　　 取吸光度波峰點(diǎn)作為最大吸收波長(zhǎng),最大吸收波長(zhǎng)在410hm左右,波峰值為0.982ABSU。顯色最佳時(shí)間及穩(wěn)定性測(cè)定整個(gè)反應(yīng)過(guò)程在30分鐘內(nèi)穩(wěn)定性良好。鈷離子濃度范圍測(cè)定值經(jīng)直線回歸相關(guān)分析,白蛋白-鈷結(jié)合線性回歸方程為:Y=0.148+0.003X,決定系數(shù)R2=0.984,P=0.001。NN濃度范圍測(cè)定值經(jīng)直線回歸相關(guān)分析,白蛋白.鈷結(jié)合線性回歸方程為:Y=0.0004-0.0415X,決定系數(shù)R2=0.98

13、5,P=0.000。標(biāo)本濃度范圍經(jīng)直線回歸相關(guān)分析,白蛋白.鈷結(jié)合線性回歸方程為:Y=1.120-0.001X,決定系數(shù)R2=0.990,P=0.000。實(shí)驗(yàn)觀察到30天內(nèi),試劑在4℃性能穩(wěn)定沒(méi)有超出范圍,試劑性能穩(wěn)定。分別采用肝素、3.2％枸櫞酸鈉和EDTA-K2作為抗凝劑,再與促凝劑作對(duì)比,評(píng)價(jià)各種抗凝劑對(duì)試驗(yàn)的影響。經(jīng)方差分析,肝素與促凝劑無(wú)顯著差異(P>0.05),3.2％枸櫞酸鈉與促凝劑對(duì)比有顯著差異(P=0.022),EDT

14、A-K2與促凝劑對(duì)比差異顯著(P=0.001)。
　　 2、改良IMA測(cè)定法的方法學(xué)評(píng)價(jià)
　　 ①改良ACB試驗(yàn)精密度評(píng)價(jià):批內(nèi)標(biāo)準(zhǔn)差為0.022、變異系數(shù)為2.38％；批間標(biāo)準(zhǔn)差為0.026,變異系數(shù)為2.86％,日間標(biāo)準(zhǔn)差為0.012,變異系數(shù)為1.36％,室內(nèi)標(biāo)準(zhǔn)差為0.027,變異系數(shù)為2.96％；②正確度評(píng)價(jià):兩種方法的相關(guān)系數(shù)是r=0.989>0.975,數(shù)據(jù)通過(guò)合適范圍檢驗(yàn)；回歸方程為:Y=1.017X-0

15、.010,R2=0.987,P=0.000,回歸標(biāo)準(zhǔn)誤為0.035；預(yù)期偏倚的上限小于允許偏倚,實(shí)驗(yàn)方法正確度性能可以接受。③干擾試驗(yàn):在加入干擾物TG<2.08 mmol/L,Hb<5.01g/L,TBIL<68.12μmol/L時(shí)無(wú)干擾；④線性分析并進(jìn)行曲線估計(jì)得到方程:Y=1.6827-2.171X,R2=0.986,P=0.001,線性良好；⑤分析靈敏度驗(yàn)證實(shí)驗(yàn):LOB=0.321；LoD=LoQ=0.360；⑥鈷離子靈敏度對(duì)比

16、試驗(yàn),通過(guò)實(shí)驗(yàn)觀察,用NN作顯色劑的敏感度高于DTT,NN作顯色劑能檢測(cè)到0.4883mg/LCoCl2；而DTT作顯色劑在CoCl2為7.8125mg/L時(shí)才會(huì)有明顯的吸光度變化,P=0.004。
　　 3、改良IMA測(cè)定法在早期診斷AMI的應(yīng)用
　　 AMI組IMA測(cè)定值為1.195±0.320,胸痛組IMA測(cè)定值為0.855±0.068,差異顯著(P=0.000)。ROC曲線下的面積為0.947,面積下的標(biāo)準(zhǔn)誤為0

17、.021,IMA測(cè)定值用于診斷AMI有顯著意義(P=0.000),IMA測(cè)定值越高,AMI的可能性越大,ROC曲線下面積的95％可信區(qū)間為(0.9050.988)。IMAcut-off值為0.906,敏感度為93.0％,特異度82.9％。
　　 結(jié)論:
　　 1、建立了以NN為顯色劑的改良IMA測(cè)定方法,確定改良ACB試驗(yàn)基本反應(yīng)條件,可應(yīng)用于全自動(dòng)生化分析儀及手工測(cè)定,適合批量測(cè)定及各級(jí)醫(yī)療單位開(kāi)展。
　　 2

18、、改良ACB法試驗(yàn)性能穩(wěn)定,檢測(cè)速度快,標(biāo)本可用血清和肝素抗凝血漿。
　　 3、改良ACB試驗(yàn)精密度和準(zhǔn)確度好,對(duì)鈷離子反應(yīng)靈敏度優(yōu)于傳統(tǒng)ACB法。
　　 4、在臨床實(shí)際遇到的急診胸痛癥狀患者人群中診斷AMI及早期診斷AMI時(shí),改良ACB法測(cè)定的IMA具有較高的診斷價(jià)值。
　　 本研究的主要?jiǎng)?chuàng)新點(diǎn):
　　 1、首次以NN代替DTT作為顯色劑,建立改良.ACB法測(cè)定IMA,并進(jìn)行了方法學(xué)評(píng)價(jià),改良ACB法能