JPH2敲減抑制小鼠心肌細胞SK2蛋白的表達.pdf

1、研究背景與目的:
　　細胞膜表面與細胞內(nèi)質(zhì)網(wǎng)(SR/ER)離子通道之間的功能交通是可興奮細胞的重要特征，而位于二者之間的耦聯(lián)膜復合體(junctional membranecomplexes，JMCs)是實現(xiàn)其有效交通的結(jié)構(gòu)基礎(chǔ)。Junctophilin(JP，JPH)是近年人們認識的與JMC形成有關(guān)并具有其特性的蛋白分子，它通過耦聯(lián)細胞膜表面與內(nèi)質(zhì)網(wǎng)上的離子通道，維持細胞內(nèi)Ca2+的穩(wěn)態(tài)。在哺乳類動物中，JPH已鑒定出JPH1，

2、JPH2，JPH3和JPH4四個亞型，而JPH2主要位于心肌細胞。已有研究表明JPH2可易化細胞膜上的電壓門控鈣離子通道(voltaged-gate calciumchannels，VGCCs)和肌漿網(wǎng)上的蘭尼堿受體(ryanodine receptors，RyRs)受體之間的功能性耦聯(lián)。
　　RyRs是真核細胞肌漿網(wǎng)膜上特有的鈣釋放通道。在哺乳類動物的組織中有RyR1，RyR2，RyR3三種亞型，在心肌細胞，通過RyR2釋放細胞

3、內(nèi)鈣完成心肌細胞興奮-收縮耦聯(lián)過程。
　　小電導鈣激活鉀通道(small-conductence calcium-activated potassiumchannels，SK)是存在于幾乎所有可興奮細胞的非電壓依賴性、通過細胞內(nèi)Ca2+激活的K+通道。根據(jù)SK2對蜂毒明肽藥理學特性的不同，可劃分為4個亞型，分別為SK1、SK2、SK3和SK4通道。存在于心肌細胞膜上的SK2通道參與動作電位復極化的構(gòu)成，并維持心臟傳導組織的節(jié)律性。

4、我們實驗室之前的研究表明心肌RyRs敏感的Ca2+釋放通道與SK2通道之間具有功能耦聯(lián)。結(jié)合近年報道的JPH結(jié)構(gòu)和功能特征，心肌RyR2與SK2通道的功能交通是否與JPH2分子耦聯(lián)相關(guān)？為驗證這一假設(shè)，我們采用RNA干擾技術(shù)，沉默心肌細胞JPH2基因，觀察JPH2的表達及其對小鼠心肌細胞SK2表達的影響，為進一步研究心肌SK通道與RyR受體之間功能耦聯(lián)的分子機制奠定基礎(chǔ)。
　　實驗方法:
　　1.采用計算機分析軟件及已有的文

5、獻報道設(shè)計2條針對小鼠JPH2 mRNA的靶序列(21 shRNA片段)，制備表達JPH2-shRNA的重組慢病毒表達載體。通過PCR和陽性克隆測序?qū)χ亟M子進行鑒定，并將重組子與慢病毒包裝質(zhì)粒共轉(zhuǎn)染293T細胞，得到重組慢病毒顆粒為Lenti-siJPH2-1和Lenti-siJPH2-2;
　　2.培養(yǎng)新生小鼠心肌細胞，將重組慢病毒顆粒感染新生小鼠心肌細胞，48h后在倒置顯微鏡下觀察綠色熒光，并通過流式細胞術(shù)檢測心肌細胞的轉(zhuǎn)染效

6、率;
　　3.通過qRT-PCR檢測重組慢病毒顆粒感染的新生小鼠心肌細胞JPH2 mRNA表達水平;
　　4.通過qRT-PCR和Western blotting檢測重組慢病毒顆粒感染的新生小鼠心肌細胞SK2 mRNA和蛋白表達水平;
　　5.統(tǒng)計學處理:利用SPSS17.0軟件對數(shù)據(jù)進行統(tǒng)計分析，采用單因素方差分析比較不同組之間的差異，以α=0.05為檢驗水準。
　　結(jié)果:
　　1.PCR和陽性克隆測序證

7、實重組JPH2慢病毒表達載體構(gòu)建成功;
　　2.新生小鼠心肌細胞培養(yǎng)2-3d可長成單層并形成細胞簇，鏡下觀察培養(yǎng)的心肌細胞可出現(xiàn)搏動，證實心肌細胞培養(yǎng)成功;
　　3.流式細胞儀檢測表明感染率MOI值為100時，Lenti-NC組、JPH2-shRNA-1組和JPH2-shRNA-2組對原代培養(yǎng)小鼠心肌細胞的感染效率分別為66.2％、66.5％，和68.4％;
　　4.qRT-PCR檢測Lenti-NC、Lenti-si

8、JPH2-1和Lenti-siJPH2-2重組病毒組JPH2 mRNA相對表達量分別為0.96±0.07、0.26±0.09和0.29±0.12。與對照組相比，兩個重組慢病毒實驗組JPH2 mRNA的表達水平顯著降低，p＜0.01;
　　5.qRT-PCR檢測Lenti-NC、Lenti-siJPH2-1和Lenti-siJPH2-2重組病毒組SK2 mRNA的相對表達量分別是1.26±0.05、0.08±0.02和0.29±0.

9、12，與對照組相比，兩個重組慢病毒實驗組SK2 mRNA的表達水平均顯著下降，p＜0.01;
　　5.重組慢病毒載體轉(zhuǎn)染心肌細胞60h，Western blotting檢測心肌SK2蛋白表達明顯被抑制。
　　小結(jié):
　　本實驗成功構(gòu)建了攜帶JPH2-shRNA的重組慢病毒載體，慢病毒載體Lenti-siJPH2-1和Lenti-siJPH2-2都可減低新生小鼠心肌細胞JPH2 mRNA表達;JPH2基因敲減也可抑制心肌