RyR2-Ca2+釋放對小鼠心肌細(xì)胞SK通道功能的調(diào)節(jié).pdf

1、心肌細(xì)胞是一種可興奮細(xì)胞，具有產(chǎn)生動作電位(action potential，AP)的能力。心肌細(xì)胞的動作電位分為兩個時期，即去極化期和復(fù)極化期。在動作電位發(fā)生期間，不同離子通道的開放和關(guān)閉導(dǎo)致不同的離子進(jìn)行跨細(xì)胞膜的流動，從而產(chǎn)生了動作電位的不同時相。
　　在靜息狀態(tài)下，心肌細(xì)胞的靜息電位大約為-70～-90 mV，受到適當(dāng)?shù)拇碳ず?，心肌?xì)胞的靜息電位產(chǎn)生去極化并且進(jìn)一步反極化達(dá)到+15～+30 mV左右，這一過程稱為去極化期。

2、去極化過程結(jié)束以后，心肌細(xì)胞的膜電位恢復(fù)到靜息電位水平，這一時期稱為復(fù)極化期。心肌細(xì)胞的復(fù)極化期存在著多種不同的跨細(xì)胞膜離子流，如Ca2+內(nèi)流及Cl-內(nèi)流，最主要的則是多種K+通道介導(dǎo)的K+外流。不同的K+通道參與了動作電位復(fù)極化的不同時期，而小電導(dǎo)Ca2+激活K+通道(small-conductance calcium-activated potassium channels，SK)介導(dǎo)的K+外流則參與了復(fù)極化過程的中晚期。
　

3、　SK通道是一類非電壓門控性的離子通道，細(xì)胞內(nèi)的Ca+是其唯一的激活途徑，因此，SK通道是一種Ca2+激活K+通道(calcium-activated potassium channels，Kca)。根據(jù)SK通道對其阻斷劑apamin敏感性的不同，SK通道又可劃分為4個亞型，即SK1、SK2、SK3和SK4。
　　在心肌細(xì)胞，最主要的SK通道是SK2通道，并且其在心房肌細(xì)胞的表達(dá)遠(yuǎn)遠(yuǎn)高于心室肌細(xì)胞。由于SK2通道參與了心肌細(xì)胞動作

4、電位的復(fù)極化過程，阻斷SK2通道則顯著延長動作電位的復(fù)極化時程。新近的研究則表明，敲除SK2通道導(dǎo)致心房肌細(xì)胞動作電位復(fù)極化時程延長，引起心房纖顫、心房撲動等心律失常發(fā)生率增高。同其它SK通道類似，SK2通道的激活與細(xì)胞內(nèi)Ca2+有關(guān)。心肌細(xì)胞動作電位產(chǎn)生期間，細(xì)胞內(nèi)的Ca2+主要有兩個來源:細(xì)胞膜上的L型電壓門控Ca2+通道（L-type voltage-gated Ca2+ channels，L-VGCC）介導(dǎo)的細(xì)胞外Ca2+內(nèi)流及

5、肌質(zhì)網(wǎng)膜上的ryanodine受體(ryanodine receptors，RyRs)介導(dǎo)的肌質(zhì)網(wǎng)內(nèi)Ca2+的釋放。
　　RyRs是存在于細(xì)胞肌質(zhì)網(wǎng)上的一種Ca2+釋放通道，因能與ryanodine特異性結(jié)合而得名。根據(jù)基因編碼的不同，RyRs在哺乳動物有3個亞型，即RyR1、RyR2和RyR3，分布于心肌細(xì)胞肌質(zhì)網(wǎng)的主要是RyR2。心肌的肌質(zhì)網(wǎng)內(nèi)含有大量的Ca2+，是心肌細(xì)胞內(nèi)的鈣庫。當(dāng)心肌細(xì)胞產(chǎn)生動作電位時，L-VGCC的開放

6、引起了Ca2+內(nèi)流。內(nèi)流的Ca2+作為細(xì)胞內(nèi)信號激活肌質(zhì)網(wǎng)膜上的RyR2通道，導(dǎo)致肌質(zhì)網(wǎng)內(nèi)貯存的Ca2+大量釋放進(jìn)入胞漿中，此過程稱為Ca2+誘導(dǎo)的Ca2+釋放(Ca2+-induced Ca2+ release, CICR)。
　　有學(xué)者發(fā)現(xiàn)，抑制心肌細(xì)胞L-VGCC后，SK2通道介導(dǎo)的電流顯著降低，而且心肌細(xì)胞動作電位復(fù)極化時程顯著延長，表明L-VGCC介導(dǎo)的Ca2+內(nèi)流引起了SK2通道的開放進(jìn)而參與了動作電位的復(fù)極化過程。但

7、是在心肌細(xì)胞產(chǎn)生動作電位的過程中，RyR2介導(dǎo)的Ca2+釋放是否參與了SK2的激活并不清楚。在神經(jīng)細(xì)胞中，RyR介導(dǎo)的Ca2+釋放是SK激活的重要途徑，但是在心肌細(xì)胞中，RyR2對SK2的調(diào)節(jié)作用未見相關(guān)文獻(xiàn)報道。為了探討RyR2-Ca2+釋放通道對SK2通道的調(diào)節(jié)作用，本研究采用離體小鼠心房肌細(xì)胞，運用全細(xì)胞膜片鉗技術(shù)和激光共聚焦鈣成像技術(shù)分別觀察了心肌細(xì)胞的動作電位和鈣瞬變，并且探討了Ry2對動作電位的時相和鈣瞬變的影響。本研究還采

8、用siRNA技術(shù)構(gòu)建了RyR2-shRNA慢病毒載體，采用熒光實時定量PCR和Western blot技術(shù)觀察了RyR2-shRNA慢病毒載體對小鼠心肌細(xì)胞RyR2表達(dá)的影響，并研究了RyR2-shRNA慢病毒載體對心肌細(xì)胞動作電位和鈣瞬變的影響。
　　第一部分:RyR2對小鼠心肌細(xì)胞動作電位的影響
　　研究方法:
　　1.采用Langendorff灌流裝置分離成年小鼠心房肌細(xì)胞:健康成年C57BL/6J小鼠，雌雄不拘

9、，抗凝及麻醉處理后取出心臟，低鈣酶消化液及KB液灌流后分離心房與心室，并制備成單個心房肌細(xì)胞懸液。
　　2.采用全細(xì)胞膜片鉗技術(shù)記錄小鼠心肌細(xì)胞的動作電位:拉制玻璃微電極并充灌電極內(nèi)液，選取狀態(tài)良好的細(xì)胞進(jìn)行封接，電流鉗模式下給予去極化刺激誘導(dǎo)動作電位，測量小鼠心肌細(xì)胞動作電位復(fù)極化達(dá)50％所需的時間(actionpotential duration at50％，APD50)及復(fù)極化達(dá)90％所需的時間(action potenti

10、alduration at90％，APD90)。RyR2抑制劑對動作電位的影響，實驗分為3組:(1)正常對照組:心肌細(xì)胞無任何處理;(2) Ryanodine組:預(yù)先加入20μM的ryanodine（RyR2抑制劑）;(3)TG組:預(yù)先加入2μM thapsigargin(TG)（鈣泵抑制劑）45min。其次，觀察了SK2通道抑制劑對動作電位的影響，實驗分為3組:(1) apamin組:上述正常對照組中記錄動作電位后，加入500 pM

11、apamin后繼續(xù)進(jìn)行動作電位的記錄;(2) ryanodine+apamin組:ryanodine組中記錄動作電位后，再加入apamin后繼續(xù)進(jìn)行動作電位的記錄;(3) TG+apamin組:TG組中記錄動作電位后，再加入apamin后繼續(xù)進(jìn)行動作電位的記錄。在以上三組中，分別將加入apamin后的APD50和APD90減去加入apamin前的APD50和APD90，求得各組中（正常對照組、ryanodine組和TG組）apamin敏

12、感的APD50和APD90。
　　3.采用激光共聚焦鈣成像技術(shù)觀察了小鼠心肌細(xì)胞內(nèi)的鈣瞬變:心房肌細(xì)胞懸液梯度復(fù)鈣，并加入終濃度為5μM的Fluo-3 AM，37℃避光孵育30 min后臺氏液沖洗三次，局部場刺激誘發(fā)鈣瞬變，采用激光共聚焦掃描系統(tǒng)記錄Ca2+Image(激發(fā)波長為488 nm)。實驗分為以下3組:(1)正常對照組:不加任何處理因素;(2) Ryanodine組:加入20μM ryanodine;(3) TG組:加入

13、2μM TG。
　　實驗結(jié)果:
　　1.在正常對照組，小鼠心肌細(xì)胞動作電位復(fù)極化50％所需的時間(APD50)約為13.7±1.9 ms，APD90約為156.5±44.7 ms(n=5)。預(yù)先加入ryanodine(n=5)或TG(n=5)，小鼠心肌細(xì)胞動作電位APD50無顯著改變(P＞0.05)，APD90顯著延長(P＜0.01)。
　　2.在正常對照組，加入apamin后（apamin組），小鼠心肌細(xì)胞動作電位的

14、APD50無顯著改變(P＞0.05)，APD90顯著延長(P＜0.001)，apamin敏感APD90為113.6±22.2 ms。
　　3.在ryanodine組(ryanodine+apamin)中，加入apamin后，小鼠心肌細(xì)胞動作電位的APD50無顯著改變(P＞0.05)，APD90顯著延長(P＜0.05)，apamin敏感APD90為51.2±6.4 ms，同正常對照組相比，apamin敏感APD90顯著減小(P＜0.

15、01)。
　　4.在TG組（TG+apamin組）中，加入apamin后，小鼠心肌細(xì)胞動作電位的APD50無顯著改變(P＞0.05)，APD90顯著延長(P＜0.05)，apamin敏感APD90為38.4±6.6 ms，同正常對照組相比，apamin敏感APD90顯著減小(P＜0.01)。
　　5.同apamin組相比，ryanodine組和TG組的APD50無顯著改變(P＞0.05)，但是APD90顯著縮短(P＜0.05

16、)。同apamin組相比，ryanodine+apamin組和TG+apamin組的APD50和APD90均無顯著改變(P＞0.05)。
　　6.給予小鼠心房肌細(xì)胞局部場刺激，心房肌細(xì)胞產(chǎn)生鈣瞬變，其增加的峰值約1.13±0.29(F/F0)(n=8)。預(yù)先加入20μM的ryanodine，給予心房肌細(xì)胞局部場刺激，鈣瞬變的峰值約0.32±0.19(F/F0)(n=8)，顯著低于對照組(P＜0.01)。預(yù)先加入2μM的TG45 m

17、in后，給予心肌細(xì)胞局部場電刺激，鈣瞬變的峰值約為0.34±0.21(F/F0)(n=10)，顯著低于對照組(P＜0.01)。
　　小結(jié):
　　1.SK2通道參與心肌細(xì)胞動作電位復(fù)極化的構(gòu)成，阻斷SK2通道使動作電位復(fù)極化明顯延長。
　　2.RyR2-Ca2+釋放參與SK2通道的調(diào)節(jié)，采用Ryanodine或TG阻斷RyR2-Ca2+釋放均使動作電位復(fù)極化明顯延長。
　　3.Ryanodine或TG可明顯抑制細(xì)胞

18、內(nèi)鈣瞬變幅度。
　　實驗結(jié)論:
　　在小鼠心肌細(xì)胞AP復(fù)極化過程中，SK2通道的激活與RyR2介導(dǎo)的Ca2+釋放有著密切的關(guān)系。
　　第二部分:RyR2-siRNA對小鼠心肌細(xì)胞動作電位的影響
　　研究方法:
　　1.新生小鼠心肌細(xì)胞的培養(yǎng):將新生小鼠心臟取出，剪碎，膠原蛋白酶和胰蛋白酶消化，差速貼壁法純化心肌細(xì)胞。
　　2.RyR2-shRNA慢病毒載體的構(gòu)建:按照siRNA的設(shè)計原則，針對小鼠Ry

19、R2基因的不同位點設(shè)計并合成4對shRNA片段，將其插入慢病毒載體psiHIV-U6-EGFP的BamHⅠ和EcoRⅠ酶切位點。測序鑒定后，分別命名為psiHV-U6-shRNA1～4。在293T細(xì)胞中包裝病毒并采用逐孔稀釋法檢測滴度，獲得慢病毒分別命名為Lenti-siRyR2-1～4。利用慢病毒及對照病毒感染小鼠心肌細(xì)胞，48h后于倒置熒光顯微鏡下觀察綠色熒光蛋白(EGFP)表達(dá)，流式細(xì)胞儀檢測EGFP陽性細(xì)胞百分比。
　　3

20、.熒光實時定量PCR(qRT-PCR)檢測RyR2 mRNA水平:慢病毒感染48h后，提取細(xì)胞總RNA，檢測RNA的完整性，進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)，進(jìn)行RyR2 mRNA的相對定量分析;
　　4.采用改良Langendorff灌流裝置分離成年小鼠心房肌細(xì)胞:健康成年C57BL/6J小鼠，雌雄不拘，抗凝及麻醉處理后取出心臟，低鈣酶消化液及KB液灌流后分離心房，制備心房肌細(xì)胞懸液。
　　5.重組慢病毒載體感染成年小鼠心房肌細(xì)胞:將成年小

21、鼠心房肌細(xì)胞置于含胎牛血清的培養(yǎng)基中培養(yǎng)1h后，再用不含胎牛血清的培養(yǎng)基換液，加入慢病毒繼續(xù)培養(yǎng)48h。
　　6.Western blot檢測:原代培養(yǎng)成年小鼠心房肌細(xì)胞，慢病毒感染48h后提取蛋白，經(jīng)蛋白電泳和轉(zhuǎn)膜后，依次加入一抗、二抗孵育，ECL法顯影并進(jìn)行圖像分析。
　　7.全細(xì)胞膜片鉗技術(shù)記錄成年小鼠心肌細(xì)胞的動作電位:拉制玻璃微電極并充灌電極內(nèi)液，選取有綠色熒光的心房肌細(xì)胞進(jìn)行封接，電流鉗模式下記錄AP，測量APD

22、50及APD90。首先觀察RyR2對AP的影響，實驗分為3組:(1)空白對照組:心肌細(xì)胞無任何處理;(2)陰性對照組:scramble siRNA感染心肌細(xì)胞48h;(3) siRyR2組:Lenti-siRyR2-2+Lenti-siRyR2-4感染心肌細(xì)胞48h。其次觀察了SK2通道抑制劑對動作電位的影響，實驗分為3組:(1) apamin組:空白對照組中，加入500 pM的apamin后繼續(xù)進(jìn)行動作電位的記錄;(2)陰性對照+ap

23、amin組:陰性對照組中，加入500 pM apamin后繼續(xù)進(jìn)行動作電位的記錄;(3) siRyR2+apamin組:siRyR2組中，加入500 pM apamin后繼續(xù)進(jìn)行動作電位的記錄。在以上三組中，分別將加入apamin后的APD50和APD90減去加入apamin前的APD50和APD90，求得各組中（空白對照組、陰性對照組和siRyR2組）apamin敏感的APD50和APD90。
　　8.采用激光共聚焦鈣成像技術(shù)觀

24、察成年小鼠心房肌細(xì)胞鈣瞬變:心房肌細(xì)胞懸液經(jīng)梯度復(fù)鈣，加入終濃度為5μM的Fluo-3 AM，37℃避光孵育30 min后臺氏液沖洗三次，局部場刺激誘發(fā)鈣瞬變并采用激光共聚焦掃描系統(tǒng)記錄（激發(fā)波長為488 nm）。整個實驗分為以下3組:(1)空白對照組:不加任何處理因素;(2)陰性對照組:scramble siRNA感染心房肌細(xì)胞48h;(3) siRyR2組:Lenti-siRyR2-2+ Lenti-siRyR2-4感染心房肌細(xì)胞4

25、8h。
　　實驗結(jié)果:
　　1.DNA測序結(jié)果表明成功構(gòu)建針對小鼠RyR2基因的psiHIV-U6-shRNA1～4。
　　2.收獲慢病毒Lenti-siRyR2-1～4的病毒滴度分別為1.2×107IU/ml、1.1×107IU/ml、1.3×107IU/ml、1.4×107IU/ml和1.1×107IU/ml。
　　3.慢病毒Lenti-siRyR2-1～4感染心肌細(xì)胞48h后，EGFP陽性細(xì)胞百分比分別為7

26、9.35％、82.47％、81.62％、87.91％和86.18％。
　　4.慢病毒Lenti-siRyR2-1～4感染心肌細(xì)胞后，RyR2 mRNA表達(dá)量顯著下降(P＜0.01)，其相對表達(dá)量分別為0.129±0.051、0.042±0.021、0.079±0.036和0.043±0.019，siRNA干擾效率分別為87.1％、95.8％、92.1％和95.7％。
　　5.慢病毒Lenti-siRyR2-2感染心肌細(xì)胞后，

27、RyR2蛋白表達(dá)量顯著下降(P＜0.05)。
　　6.小鼠心肌細(xì)胞在正常情況下，其動作電位APD50約13.7±1.9 ms，APD90約為156.5±44.7 ms(n=5)。Lenti-scramble siRNA處理心房肌細(xì)胞48 h后(n=5)，APD50和APD90均無顯著改變(P＞0.05)。Lenti-siRyR2-2+ Lenti-siRyR2-4處理心肌細(xì)胞48 h后(n=5)，小鼠心肌細(xì)胞動作電位APD50無顯

28、著改變(P＞0.05)，APD90顯著延長(P＜0.01)。
　　7.在空白對照組，加入apamin后（apamin組），小鼠心肌細(xì)胞動作電位的APD50無顯著改變(P＞0.05)，APD90顯著延長(P＜0.001)，apamin敏感APD90為113.6±22.2 ms。
　　8.在陰性對照組中，加入apamin后（陰性對照+apamin組），小鼠心肌細(xì)胞動作電位的APD50無顯著改變(P＞0.05)，APD90顯著延長

29、(P＜0.001)，apamin敏感APD90為103.6±21.5 ms，同空白對照組相比，apamin敏感APD90無顯著改變(P＞0.05)。
　　9.在siRyR2組中，加入apamin后(siRyR2+apamin組)，小鼠心肌細(xì)胞動作電位的APD50無顯著改變(P＞0.05)，APD90顯著延長(P＜0.05)，apamin敏感APD90為46.3±11.7 ms，同空白對照組相比，apamin敏感APD90顯著減小(

30、P＜0.01)。
　　10.同apamin組相比，siRyR2組的APD50無顯著改變(P＞0.05)，但是APD90顯著縮短(P＜0.05)，而siRyR2+apamin組的APD50和APD90均無顯著改變(P＞0.05)。
　　11.正常情況下，給予小鼠心房肌細(xì)胞局部場刺激，心房肌細(xì)胞產(chǎn)生鈣瞬變，的峰值約為1.13±0.29(F/F0)(n=8)。Lenti-scramble siRNA感染心房肌細(xì)胞48h后，鈣瞬變的

31、峰值約為1.09±0.22(F/F0)(n=5)，同空白對照組相比無顯著性差異(P＞0.05)。Lenti-siRyR2-2+ Lenti-siRyR2-4處理心肌細(xì)胞48h后，給予心房肌細(xì)胞局部場刺激，鈣瞬變的峰值約為0.41±0.12(F/F0)(n=5)，顯著低于空白對照組和陰性對照組(P＜0.01)。
　　小結(jié):
　　1.針對小鼠RyR2基因，本研究成功設(shè)計并構(gòu)建了四種RNAi慢病毒載體Lenti-siRyR2-1～

32、4。熒光定量PCR結(jié)果證明重組慢病毒載體Lenti-siRyR2-1/2/3/4均能高效特異地沉默RyR2基因，其中以Lenti-siRyR2-2和Lenti-siRyR2-4的效果最佳。
　　2.Lenti-siRyR2-2和Lenti-siRyR2-4轉(zhuǎn)染小鼠心肌細(xì)胞后，動作電位復(fù)極化延長，亦明顯減低鈣瞬變幅度，表明SK2的激活可能與RyR2釋放的Ca2+有著密切的關(guān)系。
　　實驗結(jié)論:
　　1.在小鼠心肌細(xì)胞AP