HBV轉(zhuǎn)基因小鼠肝臟纖維化的免疫學(xué)機(jī)制研究.pdf

1、肝臟纖維化是威脅人類健康的重大疾病。長期飲酒、脂肪肝和慢性病毒性肝炎感染是可能引起肝臟纖維化的三個(gè)重要原因。肝臟發(fā)生纖維化是許多慢性肝病發(fā)展的終末狀態(tài)，嚴(yán)重的肝臟纖維化將導(dǎo)致肝硬化甚至肝癌(hepatocellular carcinoma,HCC)的發(fā)生。肝臟纖維化過程中有許多細(xì)胞參與，包括肝臟實(shí)質(zhì)細(xì)胞與非實(shí)質(zhì)細(xì)胞。其中最受關(guān)注的效應(yīng)細(xì)胞是肝臟星形細(xì)胞（hepatic stellate cell,HSC），HSC活化后分泌大量的膠原，導(dǎo)

2、致細(xì)胞外基質(zhì)(extracellular matrix，ECM)的大量累積。近年也有研究發(fā)現(xiàn)，肝實(shí)質(zhì)細(xì)胞也參與了肝臟纖維化。同時(shí)，眾所周知肝臟具有天然免疫的優(yōu)勢(shì)狀態(tài)，這些在肝臟中大量存在的天然免疫細(xì)胞或多或少影響了肝臟纖維化的發(fā)展。我國擁有大量的乙肝（Hepatitis B virus,HBV）攜帶者，乙肝病毒感染是導(dǎo)致患者發(fā)生肝臟纖維化的重要原因。乙肝感染如何加速肝臟纖維化，肝臟中的免疫細(xì)胞如何參與其中尚無定論，其中一個(gè)重要原因是缺少

3、可以利用的小鼠模型。在本文研究中，我們對(duì)C57BL/6鼠和HBV轉(zhuǎn)基因（HBV-tg）鼠長期用肝臟毒物四氯化碳（carbon tetrachloride，CCl4）誘導(dǎo)肝臟纖維化，對(duì)肝臟損傷、病理學(xué)和纖維化相關(guān)分子進(jìn)行檢測(cè)，在機(jī)制研究中采用細(xì)胞群體的比例和數(shù)目分析、細(xì)胞清除、純化、轉(zhuǎn)輸、HSC與NKT細(xì)胞共培養(yǎng)、分離肝實(shí)質(zhì)細(xì)胞進(jìn)行原代培養(yǎng)等方法。通過上述研究手段，我們?nèi)〉玫闹饕Y(jié)果是：
　　 1、HBV-tg鼠可以自發(fā)肝臟纖維化

4、通過檢測(cè)肝臟損傷（alanine aminotransferase，ALT，病理HE染色），我們發(fā)現(xiàn)六個(gè)月大的HBV-tg鼠肝損傷明顯比相同年齡的對(duì)照鼠C57BL/6嚴(yán)重。對(duì)肝臟切片的天狼猩紅（Sirius Red）染色和纖維化相關(guān)分子的熒光定量PCR檢測(cè)，發(fā)現(xiàn)六個(gè)月大的HBV-tg鼠與C57BL/6鼠相比明顯自發(fā)肝臟纖維化。
　　 2、HBV-tg鼠對(duì)CCl4長期誘導(dǎo)的肝臟纖維化更加敏感每周兩次注射CCl4連續(xù)注射2周-14周

5、誘導(dǎo)C57BL/6鼠和HBV-tg鼠產(chǎn)生肝臟纖維化。發(fā)現(xiàn)HBV-tg鼠的肝臟纖維化更加嚴(yán)重。我們首次發(fā)現(xiàn)，HBV-tg鼠可以作為很好的模擬人的乙肝攜帶者發(fā)展為肝臟纖維化的小鼠模型。
　　 3、HBV-tg鼠NKT細(xì)胞通過活化HSC促進(jìn)了肝臟纖維化研究發(fā)現(xiàn)，給Rag1-/-鼠轉(zhuǎn)輸來自HBV-tg鼠的淋巴細(xì)胞可以引起Rag1-/-鼠肝臟纖維化，而轉(zhuǎn)輸來自C57BL/6鼠的淋巴細(xì)胞則不可以。進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn)，在急性或慢性CCl4誘導(dǎo)下，

6、HBV-tg鼠的肝臟NK細(xì)胞和NKT細(xì)胞比例和數(shù)目均比C57BL/6鼠多。通過細(xì)胞清除、轉(zhuǎn)輸?shù)葘?shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，HBV-tg鼠的肝臟NKT細(xì)胞對(duì)HSC活化具有促進(jìn)作用。同時(shí)NKT細(xì)胞也促進(jìn)了纖維化相關(guān)分子表達(dá)，從而加重了HBV-tg鼠的肝臟纖維化。
　　 4、NKT細(xì)胞通過分泌細(xì)胞因子促進(jìn)HSC的活化 NKT細(xì)胞怎樣活化HSC？我們發(fā)現(xiàn)與C57BL/6鼠相比，HBV-tg鼠在CCl4刺激下肝臟NKT細(xì)胞總數(shù)增多，同時(shí)分泌細(xì)胞因子IFN-

7、γ，IL-4和IL-13的NKT細(xì)胞數(shù)目增多。將HBV-tg鼠通過流式分選出的肝臟NKT細(xì)胞，與通過肝臟灌流分離出來的HSC共培養(yǎng)，發(fā)現(xiàn)NKT細(xì)胞可以活化HSC。如果在共培養(yǎng)體系中加入抗IL-4和IL-13的中和抗體，這種活化作用會(huì)消失；如果加入抗IFN-γ的中和抗體沒有這種作用。說明NKT細(xì)胞通過分泌Th2類細(xì)胞因子（eg，IL-4，IL-13）活化HSC。
　　 5、HBV-tg鼠的肝實(shí)質(zhì)細(xì)胞可以自發(fā)上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)變（epith

8、elial-mesenchyma-transition，EMT) HBV-tg鼠中除了NKT細(xì)胞對(duì)肝臟纖維化具有促進(jìn)作用，我們發(fā)現(xiàn)其肝實(shí)質(zhì)細(xì)胞也發(fā)揮了促進(jìn)作用。來自六個(gè)月大的C57BL/6鼠和HBV-tg鼠的肝實(shí)質(zhì)細(xì)胞通過肝臟灌流分離出來體外培養(yǎng)，可以明顯看出來自HBV-tg鼠的肝實(shí)質(zhì)細(xì)胞比來自C57BL/6鼠的肝實(shí)質(zhì)細(xì)胞表現(xiàn)出更顯著的間質(zhì)細(xì)胞表型。經(jīng)過定量PCR檢測(cè)EMT的標(biāo)志分子波形蛋白（vimentin），發(fā)現(xiàn)其在HBV-tg鼠的

9、肝實(shí)質(zhì)細(xì)胞中表達(dá)上調(diào)，更加證明HBV-tg鼠的肝實(shí)質(zhì)細(xì)胞可以自發(fā)EMT。對(duì)兩種鼠分離得到的肝實(shí)質(zhì)細(xì)胞進(jìn)行纖維化相關(guān)分子檢測(cè)，發(fā)現(xiàn)這些分子在六個(gè)月大的HBV-tg鼠中表達(dá)增高，表明HBV-tg鼠肝實(shí)質(zhì)細(xì)胞發(fā)生EMT對(duì)肝臟纖維化具有促進(jìn)作用。6、HBV-tg鼠的肝實(shí)質(zhì)細(xì)胞在CCl4誘導(dǎo)纖維化過程中通過發(fā)生EMT促進(jìn)纖維化的發(fā)生對(duì)CCl4誘導(dǎo)肝臟纖維化的HBV-tg鼠和C57BL/6鼠原代分離肝實(shí)質(zhì)細(xì)胞進(jìn)行體外培養(yǎng),在不同的時(shí)間點(diǎn)進(jìn)行拍照比較

10、，可以看出來自HBV-tg鼠的肝實(shí)質(zhì)細(xì)胞具有更加典型的成纖維細(xì)胞表型，進(jìn)一步通過定量PCR檢測(cè)vimentin，HBV-tg鼠的肝實(shí)質(zhì)細(xì)胞表達(dá)vimentin增加，說明HBV-tg鼠的肝實(shí)質(zhì)細(xì)胞在誘導(dǎo)肝臟纖維化過程中更容易發(fā)生EMT。對(duì)纖維化相關(guān)分子檢測(cè)，也發(fā)現(xiàn)在某些時(shí)間點(diǎn)這些分子表達(dá)上調(diào)。這個(gè)結(jié)果說明在CCl4誘導(dǎo)肝臟纖維化過程中，肝實(shí)質(zhì)細(xì)胞也起到促進(jìn)作用。
　　 7、NK細(xì)胞具有抑制HBV-tg鼠EMT的作用我們發(fā)現(xiàn)對(duì)HBV

11、-tg鼠注射CCl4 24小時(shí)，肝臟EMT標(biāo)志分子vimentin表達(dá)會(huì)增高。通過細(xì)胞清除實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)NK細(xì)胞對(duì)EMT具有一定的抑制作用。推測(cè)NK細(xì)胞可能通過作用在CCl4誘導(dǎo)下肝實(shí)質(zhì)細(xì)胞表達(dá)上調(diào)的DR5發(fā)揮抑制作用。
　　 8、HBV-tg鼠發(fā)生EMT對(duì)乙肝誘發(fā)肝癌具有促進(jìn)作用我們發(fā)現(xiàn)HBV-tg鼠的肝實(shí)質(zhì)細(xì)胞容易發(fā)生EMT。最新的研究顯示，EMT對(duì)癌癥發(fā)生具有促進(jìn)作用。同時(shí)我們發(fā)現(xiàn)HBV-tg鼠晚期會(huì)自發(fā)肝臟腫瘤；通過每周兩次C