B7-H1反義RNA修飾的樹突狀細胞疫苗抗胃癌作用及其機理研究.pdf

1、胃癌是最常見的惡性腫瘤之一，預后較差，如何改善預后、提高生存率是亟待解決的問題。免疫治療是腫瘤治療的一種新方法，T細胞的充分活化是腫瘤免疫治療最重要的環(huán)節(jié)，DCs可活化靜息T細胞誘導出特異性的抗腫瘤效應，在抗瘤免疫反應中發(fā)揮十分重要的作用，這在許多動物實驗和臨床研究中均已證實。但以前相關研究主要集中在如何使DCs更有效的接收和處理外來的活化T細胞的刺激性信號，近年來人們開始留意到一些本身存在于DCs表面，對DCs功能具有調節(jié)作用的免疫分

2、子，并試圖通過對這些分子的調節(jié)，提高DCs疫苗的功能。B7-H1就是近年來發(fā)現的存在于多數腫瘤細胞表面的對T細胞功能具有抑制作用的分子，高表達于成熟的DCs，B7-H1的表達是否會影響DCs對T細胞的活化以及DCs疫苗的生物學效應，這方面尚未見相關研究報道。為此，本文采用反義核酸技術，構建攜帶反義B7-H1的重組腺病毒載體，體外轉染DCs，抑制B7-H1蛋白表達，探討B(tài)7-H1反義RNA修飾的DCs疫苗抗胃癌作用及其可能的機理，以期為D

3、Cs疫苗的臨床應用提供新的方法和理論依據。 研究方法：第一部分：反義B7-H1重組腺病毒表達載體的構建。采用位置特異性重組方法構建攜帶人反義B7-H1的腺病毒載體(Ad.ASB7-H1)。通過293細胞擴增、純化制取高滴度重組腺病毒。第二部分：反義B7-H1轉染樹突狀細胞及其表達。采用常規(guī)方法從外周血單個核細胞誘導DCs成功后，以Ad.ASB7-H1轉染培養(yǎng)DCs；用RT-PCR檢測B7-H1反義RNA的表達，以蛋白質免疫印跡、

4、免疫細胞化學、RT-PCR及流式細胞術等技術檢測分析B7-H1反義RNA對B7-H1mRNA、蛋白表達及其細胞表型的影響。第三部分：B7-H1反義RNA修飾的DCs疫苗抗胃癌作用觀察。采用3H-TdR摻入法檢測Ad.ASB7-H1轉染DCs疫苗誘導的T淋巴細胞增殖能力，ELISA技術檢測Ad.ASB7-H1轉染DCs疫苗培養(yǎng)上清中IL-12的水平，采用51Cr釋放試驗檢測B7-H1反義RNA修飾的DCs疫苗抗胃癌效應，以流式細胞術分析B

5、7-H1反義RNA修飾的DCs疫苗對胃癌細胞SGC7901細胞周期的影響。第四部分：B7-H1反義RNA修飾的樹突狀細胞疫苗抗胃癌作用機理探討。以ELISA法檢測B7-H1反義RNA修飾的DCs誘導T細胞分泌IL-10、IFN-γ變化。采用流式細胞術檢測：B7-H1反義RNA修飾的DCs誘導T細胞活化率、活化T細胞凋亡率及其FasL表達變化。 研究結果：①用位置特異性重組技術成功構建了攜帶反義B7-H1的腺病毒載體(Ad.ASB

6、7-H1)，其滴度約5×1010pfu/ml；②用細胞因子GM-CSF、IL-4以及TNF-α從外周血單個核細胞誘導出具備典型特征及細胞表型的DCs，其CD1a、CD80、HLA-DR分別可達到74.32±6.05％、71.75±5.84％、75.48±5.96％。在DCs誘導成熟過程中，其B7-H1的表達逐漸增高，到第7天基本達到高峰，其陽性率可達91.25±6.86％。③重組Ad.ASB7-H1轉染DCs后各時相點，經RT-PCR均

7、可檢測到B7-H1反義RNA的表達；與未轉染組和Ad.LacZ組比較，反義B7-H1轉染組各時相點的mRNA和蛋白表達明顯減少(p＜0.01)；流式細胞術分析顯示：反義B7-H1轉染后可明顯抑制細胞表面B7-H1表達，其抑制效應在轉染后24小時即開始出現。④Ad.ASB7-H1轉染DCs刺激同種異體混合淋巴細胞反應能力增強；Ad.ASB7-H1轉染DCs分泌IL-12能力提高。⑤B7-H1反義RNA修飾的DC疫苗體外對胃癌細胞SGC79

8、01殺傷活性較未轉染細胞和Ad.LacZ轉染DCs疫苗明顯提高。B7-H1反義RNA修飾DCs疫苗可誘導胃癌細胞SGC7901凋亡并抑制其周期進展。⑥B7-H1反義RNA修飾DCs可提高T細胞CD25、CD69陽性表達率(分別可達87.61±6.46％、89.65±6.92％)與對照(74.43±3.86％)有顯著性差異；減少活化T細胞凋亡(48.45±3.78％)，與對照(66.48±6.15％)相比，二者間差異有顯著性(P＜0.05

9、)；降低活化T細胞FasL表達(74.73±7.96％)，與對照(89.89±8.14％)比，差異有顯著性(P＜0.05)。⑦B7-H1反義RNA修飾DCs可誘導T細胞IFN-γ分泌(2764±212.43pg/m1)，與對照(1736±182.31pg/ml)比有非常顯著差異(P＜0.01)；抑制其IL-10分泌(168±19.37pg/m1)，與對照(478±62.79pg/m1)比有顯著性差異(P＜0.05)。 研究結論：

10、①本研究采用位置特異性重組成功構建了攜帶反義B7-H1的腺病毒載體Ad.ASB7-H1；經293細胞擴增后獲得高滴度的重組腺病毒。②Ad.ASB7-H1轉染DCs后可穩(wěn)定的表達并能夠抑制DCs的B7-H1mRNA和蛋白的表達以及細胞因子誘導的B7-H1的表達。③B7-H1反義RNA修飾DCs后可提高DCs免疫刺激活性和IL-12分泌能力。B7-H1反義RNA修飾的DCs疫苗能夠顯著抑制胃癌細胞分裂、誘導胃癌細胞凋亡、增強抗胃癌作用。④B