B7-H1-PD-1通路在人原發(fā)性肝細(xì)胞癌中的研究.pdf

1、本研究分為四部分：
　　 第一部分：人原發(fā)性肝細(xì)胞癌中B7-H1的表達(dá)
　　 目的: 研究人原發(fā)性肝細(xì)胞癌中浸潤(rùn)性白細(xì)胞的種類(lèi)及B7-H1的表達(dá)水平。
　　 方法: 獲取人原發(fā)性肝細(xì)胞癌標(biāo)本及癌巢周?chē)谓M織標(biāo)本，一部分經(jīng)消化后，通過(guò)75%-100%雙層Ficoll 密度梯度離心法分離肝癌細(xì)胞或肝細(xì)胞以及組織浸潤(rùn)白細(xì)胞，使用CD45、CD3、CD4、CD8、HLA-DR、CD14、CD11c、B7-H1、小鼠抗人I

2、gG1 同型對(duì)照及CD123 進(jìn)行流式細(xì)胞染色，對(duì)比分析肝癌組織和癌周組織中以下細(xì)胞的比例及B7-H1 在各種細(xì)胞中的表達(dá)情況：CD45-的肝癌細(xì)胞或肝細(xì)胞、CD3+CD4+或CD3+CD8+T細(xì)胞、CD3-HLA-DR+巨噬細(xì)胞（即枯否氏細(xì)胞）、CD3-CD14-HLA-DR+CD4+CD11c+髓樣樹(shù)突狀細(xì)胞和漿細(xì)胞樣樹(shù)突狀細(xì)胞；取另一部分組織，固定在OCT 冰凍切片包埋劑中，制成冰凍切片用于熒光免疫組織化學(xué)檢查。
　　 結(jié)

3、果: 流式細(xì)胞分析及熒光免疫組織化學(xué)檢查均顯示：肝癌組織浸潤(rùn)白細(xì)胞的數(shù)量比癌周組織高，但CD4+及CD8+T細(xì)胞、枯否氏細(xì)胞、髓樣樹(shù)突狀細(xì)胞和漿細(xì)胞樣樹(shù)突狀細(xì)胞在兩者中的比例沒(méi)有差別。肝癌細(xì)胞、T細(xì)胞、髓樣樹(shù)突狀細(xì)胞和漿細(xì)胞樣樹(shù)突狀細(xì)胞表達(dá)很低水平的B7-H1。枯否氏細(xì)胞是肝癌及癌周組織浸潤(rùn)白細(xì)胞中主要表達(dá)B7-H1的細(xì)胞，且肝癌組織中B7-H1+枯否氏細(xì)胞的比例高于癌周組織。
　　 結(jié)論:與癌周組織相比，人原發(fā)性肝細(xì)胞癌中有較

4、多白細(xì)胞浸潤(rùn)，但各種白細(xì)胞的比例沒(méi)有差異，說(shuō)明肝癌微環(huán)境的免疫抑制狀態(tài)的形成原因不是浸潤(rùn)白細(xì)胞的數(shù)量和亞類(lèi)的比例，而是白細(xì)胞的功能改變。其中枯否氏細(xì)胞表達(dá)高水平的B7-H1，其可能通過(guò)B7-H1/PD-1介導(dǎo)對(duì)T細(xì)胞的抑制。
　　 第二部分：肝癌微環(huán)境促進(jìn)抗原提呈細(xì)胞表達(dá)B7-H1的機(jī)理
　　 目的: 研究肝癌微環(huán)境促進(jìn)枯否氏細(xì)胞表達(dá)B7-H1的機(jī)理。
　　 方法:；分離正常人外周血單核細(xì)胞，磁珠分選CD14+細(xì)

5、胞，與人原發(fā)性肝細(xì)胞癌細(xì)胞系Hep G2 在Transwell 體系中共培養(yǎng)48 小時(shí)。比較B7-H1 在單獨(dú)培養(yǎng)的CD14+細(xì)胞與經(jīng)過(guò)共培養(yǎng)的CD14+細(xì)胞中的表達(dá)差異，并對(duì)比篩查培養(yǎng)體系中各種細(xì)胞因子濃度。使用ELISA 進(jìn)一步檢測(cè)肝癌微環(huán)境中誘導(dǎo)B7-H1 升高的細(xì)胞因子，通過(guò)阻斷共培養(yǎng)體系中該細(xì)胞因子，或在CD14+細(xì)胞單獨(dú)培養(yǎng)時(shí)加入該種外源性細(xì)胞因子，最后檢測(cè)B7-H1的表達(dá)水平，確定肝癌微環(huán)境促進(jìn)B7-H1表達(dá)的機(jī)理。

6、>　　 結(jié)果: CD14+細(xì)胞與Hep G2細(xì)胞共培養(yǎng)后，B7-H1表達(dá)明顯升高。通過(guò)篩查和ELISA檢測(cè)，確定共培養(yǎng)體系上清中TNF-α和IL-10的量較CD14+細(xì)胞或Hep G2細(xì)胞單獨(dú)培養(yǎng)時(shí)顯著增加。阻斷TNF-α或IL-10的作用，可降低CD14+細(xì)胞與HepG2細(xì)胞共培養(yǎng)體系中B7-H1的表達(dá)量。加入外源性TNF-α或IL-10 到單獨(dú)培養(yǎng)的CD14+細(xì)胞中可誘導(dǎo)B7-H1的表達(dá)上調(diào)。
　　 結(jié)論:外周血CD14+

7、細(xì)胞是組織浸潤(rùn)巨噬細(xì)胞的前體，與肝癌細(xì)胞系共培養(yǎng)能促進(jìn)CD14+細(xì)胞B7-H1的表達(dá)，其中的TNF-α與IL-10的表達(dá)升高是主要作用機(jī)理。這提示肝癌微環(huán)境中的TNF-α與IL-10是上調(diào)抗原提呈細(xì)胞B7-H1表達(dá)上調(diào)的主要因素。
　　 第三部分：人原發(fā)性肝細(xì)胞癌中PD-1的表達(dá)，對(duì)T細(xì)胞功能的影響及PD-1+細(xì)胞與B7-H1+細(xì)胞的定位
　　 目的: 研究人原發(fā)性肝細(xì)胞癌中浸潤(rùn)性T細(xì)胞PD-1的表達(dá)情況及的表達(dá)水平及其

8、對(duì)T細(xì)胞功能的影響，并確定PD-1+細(xì)胞與B7-H1+細(xì)胞在空間上的關(guān)系。
　　 方法: 分離人原發(fā)性肝細(xì)胞癌標(biāo)本及癌巢周?chē)谓M織中浸潤(rùn)白細(xì)胞，使用CD45、CD3、CD4、CD8、PD-1、Ki-67、IFN-γ、TNF-α、Granzyme B 及Perforin進(jìn)行流式細(xì)胞染色，對(duì)比分析肝癌組織和癌周組織中T細(xì)胞PD-1的表達(dá)情況，并對(duì)比分析PD-1對(duì)T細(xì)胞增殖及表達(dá)IFN-γ/TNF-α及Granzyme B/Perfo

9、rin的影響。通過(guò)熒光免疫組化進(jìn)一步確定PD-1的表達(dá)情況，并觀察PD-1+細(xì)胞與B7-H1+細(xì)胞在空間定位上的關(guān)系
　　 結(jié)果: 流式細(xì)胞分析及熒光免疫組織化學(xué)檢查均顯示：CD8+T細(xì)胞在肝癌及癌周組織中是主要表達(dá)PD-1的細(xì)胞，且肝癌組織中PD-1+CD8+T細(xì)胞的比例高于癌周組織。CD8+T細(xì)胞在肝癌及癌周組織中是主要表達(dá)PD-1的細(xì)胞，且肝癌組織中PD-1+CD8+T細(xì)胞的比例高于癌周組織。Ki-67是細(xì)胞增殖的標(biāo)志之一

10、。癌周組織中Ki-67+CD8+T細(xì)胞的比例高于肝癌組織。重點(diǎn)分析肝癌組織中CD8+T細(xì)胞：PD-1+CD8+T細(xì)胞較PD-1-CD8+T細(xì)胞表達(dá)較少的Ki-67，IFN-γ/TNF-α及GranzymeB/Perforin。熒光免疫組織化學(xué)確定肝癌組織中CD8+細(xì)胞高表達(dá)PD-1，并且進(jìn)一步顯示：肝癌中大多數(shù)PD-1+細(xì)胞與B7-H1+細(xì)胞位于癌巢周?chē)?，且兩種細(xì)胞有相互聚集、相互作用的趨勢(shì)。
　　 結(jié)論: CD8+T細(xì)胞是發(fā)揮

11、抗腫瘤作用的主要細(xì)胞之一。肝癌中CD8+T細(xì)胞的PD-1表達(dá)增加，而增殖能力減弱。對(duì)比分析說(shuō)明PD-1的表達(dá)與CD8+T細(xì)胞的增殖能力及功能性細(xì)胞因子或酶的表達(dá)呈負(fù)相關(guān)。PD-1 在CD8+T細(xì)胞的高表達(dá)影響其抗腫瘤能力。PD-1+細(xì)胞與B7-H1+細(xì)胞常定位于癌巢周?chē)?，互相之間有聚集和作用的趨勢(shì)。這說(shuō)明肝癌中CD8+T細(xì)胞在質(zhì)（PD-1 高表達(dá)）和位（與B7-H1+有接觸趨勢(shì)）上均有與B7-H1+枯否氏細(xì)胞相互作用的優(yōu)勢(shì)。
　　

12、 第四部分：阻斷B7-H1/PD-1通路增強(qiáng)CD8+T細(xì)胞的抗腫瘤能力
　　 目的: 研究阻斷B7-H1/PD-1 通路在恢復(fù)CD8+T細(xì)胞抗腫瘤能力中的作用。
　　 方法: 分離肝癌組織浸潤(rùn)白細(xì)胞，磁珠分選CD14+細(xì)胞及CD8+細(xì)胞。體外共培養(yǎng)CD14+細(xì)胞和CD8+細(xì)胞，利用抗人CD3和CD28 抗體刺激CD8+T細(xì)胞，根據(jù)不同分組加入抗PD-1 或抗B7-H1 阻斷性抗體，以及同型對(duì)照小鼠IgG1。共培養(yǎng)五天后

13、，使用CD5、CD8、PD-1、Ki-67、IFN-γ、TNF-α、Granzyme B 及Perforin 進(jìn)行流式細(xì)胞染色，檢測(cè)阻斷B7-H1/PD-1 通路后，T細(xì)胞增殖及抗腫瘤功能是否恢復(fù)。同時(shí)利用氚摻入增殖實(shí)驗(yàn)及酶聯(lián)免疫斑點(diǎn)實(shí)驗(yàn)（ELISPOT）分別檢測(cè)T細(xì)胞的增殖能力及腫瘤抗原特異性IFN-γ分泌能力，進(jìn)一步確定阻斷B7-H1/PD-1 通路的效應(yīng)。
　　 結(jié)果: 肝癌浸潤(rùn)C(jī)D8+T細(xì)胞高表達(dá)PD-1，CD14+枯否

14、氏細(xì)胞高表達(dá)B7-H1。分選出肝癌組織中的CD14+細(xì)胞及CD8+細(xì)胞，共培養(yǎng)五天后，CD8+T細(xì)胞的增殖和抗腫瘤細(xì)胞因子或酶的表達(dá)明顯授抑制。通過(guò)加入抗PD-1 或抗B7-H1 阻斷性抗體可明顯促進(jìn)CD8+T細(xì)胞的增殖，即Ki-67表達(dá)水平及氚摻入實(shí)驗(yàn)中的CPM 值。
　　 另一方面，阻斷性治療可以恢復(fù)CD8+細(xì)胞分泌抗腫瘤細(xì)胞因子和酶的能力。同型對(duì)照抗體沒(méi)有類(lèi)似效應(yīng)。通過(guò)ELISPOT 進(jìn)一步發(fā)現(xiàn)，抗PD-1 或抗B7-H1