逼尿肌不穩(wěn)定粘連連接超微結(jié)構(gòu)變化的免疫組化監(jiān)測和電鏡觀察.pdf

1、目的：采用免疫組織化學(xué)方法及電鏡技術(shù)研究偶聯(lián)膀胱平滑肌細(xì)胞的粘連連接蛋白質(zhì)構(gòu)成，通過觀察粘連連接主要構(gòu)成蛋白成分在下尿路梗阻并發(fā)膀胱過度活動(dòng)患者中的變化，探討人逼尿肌粘連連接在膀胱不穩(wěn)定患者中的數(shù)量改變，進(jìn)而分析粘連連接與膀胱過度活動(dòng)之間的關(guān)系。揭示下尿路梗阻患者出現(xiàn)膀胱過度活動(dòng)的肌源性發(fā)病機(jī)制，為臨床提供參考。 方法：隨機(jī)選取經(jīng)尿動(dòng)力學(xué)檢查證實(shí)為逼尿肌不穩(wěn)定(detrusorinstability，DI)的BPH住院患者35例

2、，為實(shí)驗(yàn)組，年齡62-87歲，平均69.1歲；非梗阻性逼尿肌(取自膀胱癌患者)9例作為對(duì)照組，年齡57-80歲，平均66.3歲。均排除其它相關(guān)疾病。術(shù)前經(jīng)過IPSS評(píng)分。在擇期開放手術(shù)過程中獲得逼尿肌組織，并征得所有患者的書面同意(經(jīng)院倫理委員會(huì)同意)。用手術(shù)刀從膀胱前壁切取膀胱壁全層組織(約0.5×0.5×1.0cm大小)，避免組織破壞和電烙造成假象。每個(gè)離體標(biāo)本被立即分為兩份，一份約0.5 cm×0.5 cm大小，在1分鐘內(nèi)被切割成

3、約0.1 cm×0.1 cm的肌條存放入2﹪戊二醛中溶液中，用于電鏡觀察；另一份標(biāo)本約0.5×0.5 cm大小，存放入10﹪的福爾馬林中性溶液中保存。人膀胱上皮作為內(nèi)部陽性對(duì)照，人正常闌尾組織、乳腺癌和子宮內(nèi)膜癌組織作為已知的外部陽性對(duì)照。 標(biāo)本固定好，將組織塊分別進(jìn)行縱切與橫切，石蠟包埋，連續(xù)4μm切片，HE染色及用多克隆P-鈣粘蛋白抗體，單克隆α、β、和γ-連環(huán)蛋白抗體檢測，所有抗體都與粘連連接蛋白發(fā)生反應(yīng)。 電鏡

4、觀察實(shí)驗(yàn)組和對(duì)照組逼尿肌細(xì)胞連接的超微結(jié)構(gòu)。免疫組織化學(xué)方法測定各組標(biāo)本中鈣粘蛋白、α-、β-、γ-連環(huán)蛋白的表達(dá)變化，每一逼尿肌至少評(píng)價(jià)切面上10個(gè)視野，計(jì)數(shù)可見粘連連接數(shù)量，并用計(jì)算機(jī)圖像分析系統(tǒng)對(duì)膀胱逼尿肌粘連連接構(gòu)成蛋白的含量進(jìn)行半定量分析，分別計(jì)算出每個(gè)樣本中鈣粘蛋白、α-、β-、γ-連環(huán)蛋白的平均含量。分別進(jìn)行以下比較： (1) 實(shí)驗(yàn)組與對(duì)照組平滑肌中粘連連接構(gòu)成蛋白的含量； (2) 穩(wěn)定膀胱逼尿肌與伴有膀

5、胱過度活動(dòng)逼尿肌中粘連連接的數(shù)量； (3) 實(shí)驗(yàn)組平滑肌粘連連接各構(gòu)成蛋白量的變化： 結(jié)果： 1.經(jīng)免疫組織化學(xué)染色后光學(xué)顯微鏡觀察并經(jīng)計(jì)算機(jī)圖像分析系統(tǒng)進(jìn)行半定量測定(1)在非梗阻及伴有膀胱過度活動(dòng)的逼尿肌中均檢測到鈣粘蛋白、及α、β、和γ-連環(huán)蛋白的特異性染色；并且檢測到平滑肌細(xì)胞間粘連連接的特異性染色。 (2)實(shí)驗(yàn)組(DI)平滑肌切片中P-鈣粘蛋白和α、β、和γ-連環(huán)蛋白著色較淺并且不均勻，分布

6、不規(guī)則。逼尿肌細(xì)胞間粘連連接明顯減少，著色淺，周圍見較多雜亂纖維。對(duì)照組中非梗阻逼尿肌切片著色較深并且分布均勻，見大量特異性濃染的P-鈣粘蛋白和α、β、和γ-連環(huán)蛋白，肌細(xì)胞排列規(guī)則，細(xì)胞間大量粘連連接，連接著色較深，肌細(xì)胞形態(tài)規(guī)則，連接集中。實(shí)驗(yàn)組粘連連接蛋白的數(shù)量與對(duì)照組相比明顯減少(P<0.0 1)。 (3)實(shí)驗(yàn)組和對(duì)照組粘連連接的數(shù)量低于各組內(nèi)膀胱上皮粘連連接的數(shù)量(P<0.01)。 2.在電鏡下觀察(1) 實(shí)

7、驗(yàn)組(DI)肌纖維排列不整齊，肌細(xì)胞分布不均勻，肌膜周圍有高電子密度物質(zhì)堆積，細(xì)胞間以胞突連接及縫隙連接(gapjunction，GP)為主：細(xì)胞間隙明顯增寬，可見大量膠原纖維；平滑肌細(xì)胞間連接明顯減少或消失，逼尿肌細(xì)胞出現(xiàn)肥大，線粒體腫脹、破裂； (2) 對(duì)照組平滑肌纖維排列整齊，肌細(xì)胞分布均勻，肌細(xì)胞間隙細(xì)胞之間連接以粘連連接(adherens junction，AJ)為主，細(xì)胞間的彈性纖維和膠原纖維含量較少，逼尿肌細(xì)胞內(nèi)