氧濃度對(duì)蛻膜基質(zhì)細(xì)胞成骨分化的影響.pdf

1、目的：
　　 研究發(fā)現(xiàn)，骨組織工程的種子細(xì)胞骨髓干細(xì)胞數(shù)量有限，取材及增殖分化困難，在臨床應(yīng)用中也受到病人經(jīng)濟(jì)條件的制約；而近期研究表明蛻膜基質(zhì)細(xì)胞（Decidual Stromal Cells，DSC）可在一定條件下誘導(dǎo)為成骨細(xì)胞。本實(shí)驗(yàn)通過(guò)體外分離培養(yǎng)人早孕蛻膜基質(zhì)細(xì)胞，并對(duì)其進(jìn)行體外培養(yǎng)、擴(kuò)增；將部分蛻膜細(xì)胞向成骨細(xì)胞(Osteoblast，OB)方向誘導(dǎo)；觀察常氧、低氧條件下蛻膜細(xì)胞的增殖情況及體外成骨能力，探討氧對(duì)蛻膜

2、細(xì)胞誘導(dǎo)成骨能力的影響。
　　 方法：
　　 取人工流產(chǎn)6～8周妊娠蛻膜組織，采用機(jī)械研磨法分離蛻膜，復(fù)合酶消化，傳代自然增殖法純化細(xì)胞，進(jìn)行體外培養(yǎng)擴(kuò)增。倒置顯微鏡觀察其大體形態(tài)，當(dāng)細(xì)胞傳至第五代以后性狀較穩(wěn)定，所以采用第六代蛻膜基質(zhì)細(xì)胞進(jìn)行成骨誘導(dǎo)分化培養(yǎng)。將細(xì)胞消化后吹打均勻，分為四組種入6孔板中：(1)DSC常氧對(duì)照組(2)DSC常氧成骨誘導(dǎo)培養(yǎng)組(3)DSC低氧對(duì)照組(4)DSC低氧成骨誘導(dǎo)培養(yǎng)組。將培養(yǎng)基更換

3、為成骨誘導(dǎo)液，每隔兩至三天換一次液，持續(xù)誘導(dǎo)28天，每7天用PNPP法檢測(cè)各組細(xì)胞的堿性磷酸酶(ALP)活性的表達(dá)，酶標(biāo)儀測(cè)定光密度值（OD值）及茜素紅染色觀察礦化結(jié)節(jié)形成情況。
　　 結(jié)果：
　　 1．機(jī)械研磨及復(fù)合酶消化結(jié)合傳代自然增殖法純化細(xì)胞，獲取高純度的蛻膜基質(zhì)細(xì)胞，且保持了較好的細(xì)胞活性。
　　 2．蛻膜基質(zhì)細(xì)胞在成骨誘導(dǎo)液的作用下，三天后明顯形成集落，細(xì)胞明顯變大，并呈明顯的多邊形、三角形、不規(guī)則形

4、，細(xì)胞體積比加誘導(dǎo)液之前明顯增大，胞漿透明，內(nèi)含少量顆粒樣或條索樣高密度結(jié)構(gòu)（附圖1，2）；成骨誘導(dǎo)10天，細(xì)胞層疊生長(zhǎng)，細(xì)胞密集，中央可見(jiàn)類似結(jié)節(jié)狀結(jié)構(gòu)（附圖3）。經(jīng)誘導(dǎo)后的細(xì)胞增殖較為緩慢，10～14天細(xì)胞才達(dá)到90％融合；對(duì)照組加入了常規(guī)培養(yǎng)基（1640培養(yǎng)基+10％FBS），細(xì)胞體積較小，呈長(zhǎng)梭形，偶見(jiàn)多邊形，細(xì)胞增殖較快，大約5～7天可達(dá)到90％的細(xì)胞融合。
　　 3．酶標(biāo)儀檢測(cè)光密度值（OD值）、各組ALP活性表達(dá)顯

5、示：DSC常氧成骨誘導(dǎo)培養(yǎng)組的ALP活性表達(dá)明顯高于其他三組(P＜0.05);DSC低氧成骨誘導(dǎo)培養(yǎng)組的ALP活性表達(dá)明顯高于兩個(gè)常規(guī)培養(yǎng)基培養(yǎng)組(P＜0.05)：
　　 4．四組樣本培養(yǎng)7天，14天，21天，28天后茜素紅染色，成骨誘導(dǎo)組細(xì)胞密集區(qū)有礦化結(jié)節(jié)形成（附圖4），茜素紅染色呈橘紅色，常氧成骨誘導(dǎo)培養(yǎng)比低氧成骨誘導(dǎo)培養(yǎng)組明顯，其余兩組未見(jiàn)。
　　 結(jié)論：
　　 1．蛻膜基質(zhì)細(xì)胞在一定條件下可以誘導(dǎo)分化為