海洋真菌化合物STb對(duì)GH3細(xì)胞的毒性作用及其相關(guān)機(jī)制的體外研究.pdf

1、本文主要從以下幾部分展開(kāi)： 第一部分抗垂體腺瘤候選化合物的初篩 目的：垂體腺瘤是人體內(nèi)常見(jiàn)的內(nèi)分泌腫瘤，長(zhǎng)期以來(lái)由于治療藥物有限以及耐藥現(xiàn)象的不斷發(fā)生，其治療效果常常不能使醫(yī)生和患者滿意，因而臨床迫切需要高效低毒的新藥誕生。天然產(chǎn)物一直是創(chuàng)新藥物的一個(gè)重要來(lái)源，海洋微生物化合物的研究引起了越來(lái)越多的重視。我們從我國(guó)南海紅樹(shù)林真菌天然產(chǎn)物庫(kù)中篩選出具有抗垂體腺瘤活性的化合物作為抗垂體腺瘤藥物的候選化合物。 方法：我

2、們選擇大鼠垂體瘤GH3細(xì)胞作為垂體腺瘤的體外篩選模型，對(duì)中山大學(xué)化學(xué)與化工學(xué)院從我國(guó)南海紅樹(shù)林真菌代謝產(chǎn)物中提取的16種未知化合物進(jìn)行抗垂體腺瘤作用的篩選。以100uM的高濃度為篩選濃度處理GH3細(xì)胞48h，通過(guò)MTT比色法(3-(4，5-Dimethylthiazol—2-yl)—2，5-diphenyltetrazolium bromide)觀察細(xì)胞的增殖狀況，對(duì)照為含0.1％DMSO的不加藥組，通過(guò)與對(duì)照組比較選擇能夠明顯抑制細(xì)胞

3、增殖的化合物為抗垂體腺瘤候選化合物。 結(jié)果：通過(guò)MTT法對(duì)一系列海洋化合物抗垂體腺瘤增殖作用進(jìn)行篩選，結(jié)果顯示16種化合物中有15種對(duì)GH3細(xì)胞增殖狀況無(wú)明顯作用，僅一種代號(hào)為STb的化合物在100uM處理48h可明顯殺傷GH3細(xì)胞，與對(duì)照組相比其抑制率幾乎可達(dá)到100％。 結(jié)論：絕大多數(shù)海洋真菌活性產(chǎn)物對(duì)垂體腺瘤GH3細(xì)胞的生長(zhǎng)無(wú)明顯抑制作用，僅有個(gè)別化合物對(duì)GH3細(xì)胞具有明顯的抑制作用。STb是一種活性較好的抑制垂體

4、腺瘤增殖的海洋真菌化合物，我們將其納入抗垂體腺瘤候選化合物并對(duì)其進(jìn)行進(jìn)一步的藥理及機(jī)制的研究。 第二部分 STb對(duì)垂體腺瘤GH3細(xì)胞的毒性作用及機(jī)制探討 目的：研究海洋真菌化合物STb對(duì)大鼠垂體瘤細(xì)胞系(GH3細(xì)胞系)的毒性作用和激素表達(dá)水平的影響并對(duì)其機(jī)制進(jìn)行初步探討，期望可以找到具有治療垂體腺瘤的潛力的新化合物。 方法：我們通過(guò)MTT法用不同濃度的STb(4，2，1，0.5，0.25，0.125uM)處理GH

5、3細(xì)胞48h，觀察其抑制GH3細(xì)胞的濃度依賴性并計(jì)算STb的IC50。同時(shí)我們還用MTT法觀察了高、中、低三組濃度(0.6，0.3，0.2uM)的STb處理GH3細(xì)胞7天的時(shí)間依賴性。根據(jù)STb的時(shí)間、濃度依賴性以及IC50，我們選擇最佳濃度為0.3uM進(jìn)行進(jìn)一步機(jī)制的探討。用Tunel法和流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)不同時(shí)間點(diǎn)GH3細(xì)胞的凋亡情況以及隨著作用時(shí)間的延長(zhǎng)GH3細(xì)胞的細(xì)胞周期的變化情況，并用Caspase抑制劑Z—VAD—FMK預(yù)處理G

6、H3細(xì)胞，觀察caspase通路在細(xì)胞凋亡中的作用。用Western—blot法和RT—PCR法檢測(cè)STb對(duì)GH3細(xì)胞生長(zhǎng)激素表達(dá)水平的影響。 結(jié)果：STb對(duì)GH3細(xì)胞的抑制作用具有時(shí)間、濃度依賴性，隨著濃度和時(shí)間的延長(zhǎng)細(xì)胞死亡率明顯增加，細(xì)胞死亡以凋亡為主且有明顯的細(xì)胞周期G1/S期阻滯作用，Caspase抑制劑Z—VAD—FMK可部分減輕STb對(duì)GH3細(xì)胞的促凋亡作用，提示STb對(duì)GH3細(xì)胞的促凋亡作用可能與caspase相

7、關(guān)蛋白激活有關(guān)；STb在殺傷GH3細(xì)胞的同時(shí)可明顯抑制細(xì)胞內(nèi)的生長(zhǎng)激素的水平，但未見(jiàn)細(xì)胞內(nèi)GH mRNA水平發(fā)生明顯變化，提示STb作用靶點(diǎn)可能在翻譯及翻譯后修飾階段。 結(jié)論：STb可能通過(guò)促進(jìn)細(xì)胞凋亡和細(xì)胞周期阻滯的機(jī)制抑制GH3細(xì)胞增殖，其凋亡發(fā)生與激活caspase相關(guān)蛋白有關(guān)。STb可有效的抑制GH3細(xì)胞內(nèi)生長(zhǎng)激素的水平但GH mRNA表達(dá)水平未見(jiàn)明顯變化，表明STb未從基因水平降低激素表達(dá)，其可能通過(guò)作用于翻譯或翻譯后